2010.11.15表观遗传学培训.ppt

表观遗传学Epigenetics,什么是表观遗传学？,表观遗传： 在DNA或RNA序列不发生变化的基础上，通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA与其他分子的相互作用，基因表达状态的可遗传性的改变,研究意义,疾病的研究,从DNA或RNA序列上寻找病因,片面的手段,序列之外的调控基因的信息 （表观遗传学）,全面的手段,表观遗传学的分子机制,DNA甲基化RNA干扰组蛋白修饰染色质改型 (ChIPRIP端粒端粒酶),什么是DNA甲基化,研究得最清楚、也是最重要的表观遗传修饰形式。主要是基因组DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC),DNA甲基化,发生时间： DNA复制之后、转录之前主要形式,原核生物： CCA/TGG和GATC常被甲基化,真核生物：甲基化仅发生于胞嘧啶,DNA甲基化的功能,是细胞开闭基因表达的一种方式，基因表达水平与其甲基化水平呈负相关。例如： DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则可能使基因过度表达，进而引起肿瘤或癌症的发生。如促肿瘤生长因子IGF2基因过度表达会引发大肠癌。,DNA甲基化检测方法,甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR, MSP）,DNA甲基化分析检测试剂,亚硫酸氢钠通用修饰试剂盒甲基化与非甲基化的基因组对照,DNA甲基化分析检测试剂盒,特定基因扩增试剂盒 CpG Wiz Kits针对各种特定基因而设计，使检测针对性强，灵敏度高（仅需1ng的DNA），省去了设计、合成引物的时间。 有针对以下20种特定基因的试剂盒：APC、BRCA1、DAP Kinase、E-cadherin、ER、Fragile X、 GST-pi、HIN、hMLH1、 MGMT、p14/ARF、p15、p16、Prader Willi/Angelman、PAR2、 RASSF1A、Rb1、SOCS1/ASC、TMS1/ASC、VHL。每套试剂里有特定基因的甲基化和非甲基化的扩增引物，同时含有甲基化与非甲基化的全基因组对照样品，与亚硫酸氢钠通用试剂盒配合使用。,RNA干扰（RNA interference, RNAi）,定义： 正常生物体内抑制特定基因表达的一种机制，由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。应用： 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。,RNA干扰（RNA interference, RNAi）,引起RNAi的分子: siRNA、miRNA siRNA转染试剂,组蛋白修饰,组蛋白： 所有真核生物的细胞核中，与DNA结合存在的碱性蛋白质的总称组蛋白修饰： 通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，从而改变染色质的疏松或凝集状态，或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用。,组蛋白修饰,地位 基因正常表达除了需要相应转录因子的诱导和启动子区处于低甲基化状态外，还需要具备另外一个表观遗传学条件，即组蛋白修饰处于激活状态修饰类型,乙酰化,甲基化,磷酸化,泛素化,SUMO化,Citrullination 瓜氨酸化,组蛋白乙酰化（Acetylation）,组蛋白乙酰化（Acetylation）分析,组蛋白磷酸化(Histone phosphorylation)分析,在DNA损伤修复、细胞周期调控、基因组稳定维持和肿瘤抑制中起重要作用,组蛋白甲基化（Histone Methylation）,甲基化可以抑制基因表达(H3-K9、H3-K27、H4-K20)也可以具有激活效应(H3-K4、H3-K36、H3-K79 ),组蛋白,修饰位点,组蛋白甲基化（Histone Methylation）,组蛋白泛素化(Ubiquitinization),组蛋白SUMO化修饰(Sumoylation),SUMO化修饰 是一个由多种酶共同参与调控的级联酶促反应过程(类似泛素化修饰)，参与蛋白的核转运，基因转录，细胞凋亡，蛋白稳定，应激反应，和细胞周期等，但不直接介导蛋白的降解。,组蛋白瓜氨酸化（Citrullination）,染色体免疫沉淀（ChIP）,Chromatin Immunoprecipitation： 是体内分析DNA-蛋白质相互关系的技术，能够完整、真实的反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。意义：判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系检测体内反式因子与DNA的动态作用,电泳迁移率分析(EMSA)不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况。,* 体内染色质高级结构的存在使DNA 与蛋白质难以接近* 染色质结构本身是动态的* DNA-蛋白质相互作用通常是瞬时的,ChIP流程,ChIP涉及的试剂,qPCR,/magnetic,ChIP Kits,对DNA或DNA-蛋白质损伤小，效率更高,ChIP Abs,ChIPProtein A or G?,蛋白A、G是微生物来源的天然蛋白质，可以和哺乳动物的免疫球蛋白结合，结合能力受到IgG的来源及亚型影响：,根据不同的IgG的亲和力选择，小鼠多用Protein G。兔抗两者都可，也倾向于选择Protein A。,ChIPAgarose vs. Magnetic Beads?,RNA结合蛋白免疫沉淀分析(RIP),定义： RIP是分析体内RNA-蛋白质相互关系的技术，能够真实反映体内mRNA转录后表达调控的情况研究领域： RNA与肿瘤、艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，对RNA（miRNA）的研究越来越热,RIP试剂盒,全世界第一个完整的专门研究RNA与蛋白相互作用的Kit (Cat# 17-701),RIP试剂盒的工作原理,RIPAb+ 抗体引物套装,RBP (RNA Binding Protein)抗体80种,端粒和端粒酶研究,端粒 染色体两末端的结构为端粒，端粒也被科学家称作“生命时钟”。在新细胞中，细胞每分裂一次，端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂而死亡。端粒酶 端粒酶具有对端粒的延伸作用，在没有端粒酶的细胞中，端粒会逐渐缩短直至