油脂下脚料降解(医学版).doc

不同菌种对三种油脂下脚料降解情况的初步研究*吴民熙，詹逸舒，刘仁萍，吴永尧(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙，410128，中国)摘 要：在土壤样中分离到3株高产中性蛋白酶的菌株，命名为DB2 、B1 、Qm，以发酵液中的单位蛋白酶活力和生物量为指标，利用该三株菌分别对大豆粕、菜籽饼、茶籽饼作为发酵基质进行了初步的降解蛋白能力比较研究，结果表明DB2 、B1 、Qm均能很好的降解三种粕中的粗蛋白。经初步鉴定DB2 、B1 为芽孢杆菌，Qm为曲霉。实验初步表明，同属的芽孢杆菌菌株对大豆粕、菜籽饼和茶籽饼的降解能力相近，芽孢杆菌和曲霉对大豆粕的降解能力相近，对菜籽饼的降解能力不同，对茶籽饼的降解能力相近。关键词： 芽孢杆菌，曲霉，油脂下脚料，蛋白酶酶活，生物量中图分类号：Q939.96 文章标识码：APrimariry studies of various strains on degradation in different greasyfoot*Wu Min-xi, Zhan Yi-shu ,Liu Ren-ping,Wu Yong-yao（College of Bioscience & Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)Abstract： Three high yield proteases-producing strains named as DB2 、B1 、Qm were isolated from the soil samples. According to the proteolytic activity and biomasses of strains protease on 1g of greasyfoot，the results showed that the content of protein in soybean meal, rapeseed meal，teaseedcake has descended after fermentation with DB2 、B1 、Qm. They were identified as Bacillis sp. DB2, Bacillis sp. B1 and Aspergillus sp. Qm . The first stage over the trial indicates same strains of Bacillus has fair degradation speed and capability of soybean meal and rapeseed meal. The analogous degradation speed of soybean meal and teaseedcake but discrepancy degradation speed of rapeseed meal by Bacillus and Aspergillus.Key words: Bacillus; Aspergillus; Greasyfoot; Proteinase Activity; Biomasses 油脂下脚料，是植物种子或果核经榨油后的副产品，如菜籽饼、芝麻饼、茶籽饼、花生饼、蓖麻饼、大豆粕等，平均含有30%50%的粗蛋白质, 氨基酸组成较全面,以及氮、磷、钾和丰富的微量元素，一般作基肥、种肥或追肥1。我国每年下脚料总量在1000万吨以上,长期以来没有得以充分利用2，而利用高产蛋白酶菌种降解油脂下脚料的是解决该问题较实用的方法,但不同种类菌种对不同油脂下脚料降解情况相关研究鲜见报道，本项目组从自然界搜集产蛋白酶菌种并通过酪蛋白水解圈法，初筛出水解圈比值较大的菌株，再摇瓶培养测定这些菌株蛋白酶活力，最后筛选出三株高产蛋白酶的菌株，经过以大豆粕、菜籽饼、茶籽饼为基质的发酵研究，比较这些菌株对不同油脂下脚料的降解能力及其在不同油脂下脚料中的生长情况，为其在农业上的生产应用提供理论和实验依据。*基金项目：湖南省中南烟草实验站项目(08-10Aa02)作者简介：吴民熙，（1983-），男，汉族，湖南长沙人，硕士研究生，主要研究方向为生化与发酵工程。通信地址：湖南农业大学芷兰研究生公寓南505。邮编：410128 ，E-mail：通讯作者：吴永尧 收稿日期：1 材料与方法11 材料111 试剂及设备福林试剂、干酪素、酪氨酸大豆粕，菜籽饼，茶籽饼均为湖南省金叶肥料公司提供。紫外可见分光光度计 Tu-800； HH 型电热恒温水浴锅；PQX 型多段可控人工气候箱；超净工作台 ；高压灭菌锅、恒温摇床机等。112 菌株及培养基（1）菌株为本实验室筛选并保藏，经初步鉴定菌种DB2 、B1为芽孢杆菌；Qm为曲霉（2）牛肉膏细菌保存培养基（3）马铃薯培养基(PDA)（4）种子培养基：牛肉膏 5gL，蛋白胨10 gL，Nacl 5 gL，pH 7.2（5）马铃薯种子培养基：20马铃薯溶液，2葡萄糖，水100mL ,pH 7.2113 菌种活化及种子液制备将营养肉汤(或PDA)培养基装于三角瓶中，封口包扎后，于 121灭菌 2 0 min ；冷却后接入斜面培养2 4 h的菌株一环，温度3 5条件下摇瓶培养24 h 。 114 摇瓶发酵培养250ml三角瓶装料4.0g，H2O 100ml，0.1MP，121 灭菌30min，趁热摇散，冷后接入种子液，于3 5 恒温培养48h。115 蛋白酶酶活测定参照福林法3-6。酶活力定义：在40条件下，l mL发酵液在1 min内水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位(U)，单位为UmL。转换成U/g单位时需除以样品干物质的含量。1.2 菌种的生物量测定按常规平板菌落计数法测定7。1.3菌种的鉴定按照伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册8、真菌鉴定手册9有关章节进行初步鉴定。2 结果与讨论2.1 初步鉴定结果DB2 、B1菌株的特征为菌落初呈乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，镜检菌体为杆状，幼龄菌革兰氏呈阳性，成熟后呈阴性，以成对或链状排列，培养24h后菌体出现芽孢，芽孢（中生）呈椭圆，有鞭毛，再根据其生理生化特征，初步鉴定为芽孢杆菌；Qm 菌落初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形，最适生长温度3035，初步鉴定为黑曲霉。2.2 不同菌株降解三种油脂下脚料蛋白能力和生物量的比较油脂下脚料中平均含30%50%的粗蛋白，微生物所产蛋白酶可降解粗蛋白，蛋白酶活力可作为对油脂下脚料降解程度的参考指标之一。从土样等样品中获得3株高产蛋白酶菌株，即DB2、Qm、B1,为了进一步比较它们所产蛋白酶活力，分析了该3株菌在大豆粕，菜籽饼，茶籽饼三种产酶发酵培养基中产蛋白酶能力和生物量。2.2.1 三株菌种分别在不同油脂下脚料中的降解情况图1 菌株DB2对不同油脂下脚料降解情况比较Fig .1 The enzyme activity of strain DB2 on degradation in different greasyfoot图2. 菌株Qm 对不同油脂下脚料降解情况比较Fig. 2 The enzyme activity of strain Qm on degradation in different greasyfoot 图3.菌株B1对不同油脂下脚料降解情况比较Fig.3 The enzyme activity of strain B1 on degradation in different greasyfoot2.2.2 不同菌种在同一油脂下脚料中的降解情况图4. 三株菌种对大豆粕的降解情况比较Fig, 4 The enzyme activity of various strains on degradation in soybean meal图5. 三株菌种对菜籽饼的降解情况比较Figure 5. The enzyme activity of various strains on degradation in rapeseed meal图6. 三株菌种对茶籽饼的降解情况比较Figure 6. The enzyme activity of various strains on degradation in camellia dregs由图1-3可知，三种菌株在大豆粕酶活都较高，其中，DB2达到了259.6U/mL，Qm达到了227.8U/mL，B1达到了218.4U/mL与有关研究10比较，可知该三株菌的酶活力较高，可作为良好的生产蛋白酶菌株。三种菌株在大豆粕中酶活最高，在茶籽饼中酶活最低，产生这一差异的原因可能是该三种油脂下脚料主要成分有差异，粗蛋白含量大豆粕菜籽饼茶籽饼,粗脂肪含量依次为大豆粕菜籽饼茶籽饼 11-13，粗脂肪含量越低，粗蛋白质越高可能越有利于菌株的生长及蛋白酶的合成。由图1，3可知，菌株DB2 、B1 经初步鉴定为芽孢杆菌属的不同种，但DB2 、B1在三种油脂下脚料中酶活均为大豆粕中酶活最高，在茶籽饼中酶活最低，这可能说明同属的芽孢杆菌不同种菌株对三种油脂下脚料降解能力相近。由图2可知,菌株Qm在三种油脂下脚料的酶活不同，特别是在茶籽饼中酶活最低只有16.3 U/mL，但生物量与其他两种油脂下脚料中的相近，产生这种情况的原因可能是菌株在茶籽饼中生长旺盛，但被抑制蛋白酶的分泌。由图4可知，菌株B1 、Qm经初步鉴定分别为芽孢杆菌和黑曲霉，但两菌株在大豆粕中酶活十分相近，这可能说明此两株不同属的菌种对大豆粕的降解能力相近。Qm在大豆粕中产生与B1相近酶活，但生物量是B1的17倍（Qm 、B1的酶活分别是227.8 U/mL，218.4 U/mL，生物量分别是390x106，20x106个），表明黑曲霉Qm单细胞产蛋白酶能力仅为芽孢杆菌B1的1/17;由图5可知Qm在菜籽饼中酶活是的DB21.5倍，B1的3倍，这可能说明此两种不同属的菌种对菜籽饼的降解能力不同。由图4-6可知，三株菌种在茶籽饼中的蛋白酶活较其他油脂下脚料都低，但也有区别，分别为DB2 35.3 U/mL、Qm 16.3 U/mL、B1 19.4 U/mL, 这可能说明此两种不同属的菌株对茶籽饼的降解能力不同，初步分析，茶籽粕中的营养成分与大豆粕、菜籽饼不同，不利于DB2、Qm、B1的生长代谢，从而影响它们的蛋白酶表达水平。3 结语（1）三种菌株对大豆粕蛋白酶酶活都较高，都可应用于降解大豆粕的生物有机肥生产。菜籽饼是一种营养价值很高的植物蛋白资源,其潜在营养价值与脱脂大豆粕不相上下,其生物效价和利用率甚至超过脱脂大豆蛋白。但由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖甙及植酸、单宁、芥子碱等14毒性物质或抗营养物质,因而降低了菜籽饼的利用价值。为了更加充分地利用菜籽饼这种优良的植物蛋白资源,各国科学家都纷纷开展菜籽粕综合利用方面的研究。目前国内外菜籽粕脱毒的方法主要有:物理脱毒法、化学脱毒法及生物学脱毒法3大类。物理脱毒法、化学脱毒法都有很大缺陷15 ,微生物发酵法是生物脱毒法的一种,它是利用微生物直接分解毒物,与其他方法相比,该法具有条件温和,干物质损失小等优点。试验筛选到的菌株Qm在菜籽饼中的蛋白酶酶活和生物量均高于其他菌株，体现出对菜籽饼有较好的降解效果和适应性，可作为降解菜籽饼的菌株使用，为研制新型微生物发酵菜籽饼饲料蛋白及饲料进行有益探索。（2）茶籽饼所含物质导致三株菌种在的蛋白酶酶活和生物量较其他油脂下脚料都低。茶籽饼中含有茶皂素20%-25%，茶皂素是一种天然的表面活性剂, 尽管茶皂素的起泡能力不强, 但其泡沫稳定性极强, 而且起泡力不受水的硬度变化的影响, 发泡性能较好16，由菌种生理生化特征可知为DB2 为兼性菌，B1为好氧菌，因此，在摇瓶发酵中产生的泡沫影响菌液的溶氧量，抑制菌种生长，同时影响了菌种产蛋白酶的量。茶籽饼中还含有生物碱等有毒物质，常应用于杀菌，此特点也导致三菌株在茶籽饼中的生物量也相对较低。本项目组将利用文中筛选到的菌株及实验室保存的具有其他不同酶学性质的菌株，进行在不同油脂下脚料的降解研究，以期筛选出更多高效降解油脂下脚料的菌种，作为种质资源储备并对其酶解产物进行分析，为油脂下脚料综合开发利用提供一定的理论基础和试验依据。参考文献1 薛志成.饼粕在饲料中的合理利用J 湖南饲料,2005,3:28-292 汪习生、罗继权.餐饮泔水油及废动植物油下脚料深加工利用大有可为. 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