高中生物 专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段课件 新人教版选修1.ppt

课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 课题背景 在刑事侦破案件中常需要对样品dna进行分析 pcr技术能快速扩增dna片段 在几个小时内复制出上百万份的dna拷贝 有效地解决了因为样品中dna含量太低而难以对样品进行分析研究的问题 现在pcr技术已广泛应用于遗传病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和基因测序 课题目标 1 理解pcr的原理和反应过程 2 尝试pcr技术的基本操作 3 讨论pcr技术的应用 pcr仪 以 dna复制 为背景材料 设计问题 导入新课 首先回顾dna的结构和复制的有关知识 然后了解pcr技术的原理和应用 接着讲解pcr技术的反应过程及具体实验操作步骤 后以视频观看来再次学习实验的知识点 最后通过课堂检测完善所学内容 通过对pcr反应过程的教学 应以读图识图为主 教材中反应过程图解详细的描绘了参与pcr的各种组成成分 每一轮反应的三个基本步骤 变性 复性 延伸 每一步骤的作用 在教学中分析图形的同时 结合教科书中的文字说明来加深理解 1 胞内dna复制的基本体系 一 基础知识 打开dna双链 提供dna复制的模板 合成子链的原料 催化合成dna子链 使dna聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 一 pcr原理 2 dna双链方向与复制关系 2 dna聚合酶只能从3 端延伸dna链 故dna复制需要引物 1 dna的羟基 oh 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 dna合成总是从子链的5 端向3 端伸 3 端 5 端 3 pcr原理 1 dna的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 变性 80 100 c的温度范围内 dna双螺旋结构解体 双链分开 加热变性 复性 温度缓慢降低后 两条彼此分离的dna链重新结合成双链 缓慢冷却复性 2 耐高温的taqdna聚合酶 3 缓冲液为pcr反应提供的物质 dna模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的dna聚合酶 同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行 方法点拨 细胞内复制和pcr不同点 pcr过程需要的引物不是rna 而是人工合成的dna单链 其长度通常为20 30个脱氧核苷酸 pcr过程中dna的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 二 pcr的反应过程 pcr一般要经历三十多次循环 每次循环分为变性 复性和延伸三步 1 变性 温度上升到90 以上时 双链dna解旋为单链 2 复性 温度下降到50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 温度上升到72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在dna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 3 延伸 方法点拨 1 72 左右时 taqdna聚合酶有最大活性 可使dna新链由5 端向3 端延伸 2 dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dna序列 使该段固定长度的序列呈 指数式 扩增 标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 92 50 72 b 72 50 92 c 50 92 72 d 80 50 72 栏目链接 典型例题 a 方法点拨 1 变性 温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解旋为单链 2 复性 温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 3 延伸 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 二 实验操作 1 pcr仪 一 设备及用具 一台能够自动调控温度的仪器 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移pcr配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 1 准备 2 移液 二 实验操作步骤 按照pcr反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照pcr反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 3 混合 过程 盖严微量离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 注意 a 离心管口的盖子一定盖严 防止实验中脱落或液体外溢 b 手指轻轻弹击微量离心管的管壁 目的是使反应液混合均匀 4 离心 过程 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的 使反应液体集中在离心管底部 提高反应效果 5 反应 将离心管放入pcr仪上 设置好pcr仪的循环程序 注意事项 避免外源dna等因素的污染 隔离操作区 所用微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头 在pcr实验操作中 下列说法不正确的是 a 在微量离心管中添加各种试剂时 只需一个枪头b 离心管的盖子一定要盖严 防止液体外溢c 用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合d 离心的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 变式训练 栏目链接 典型例题 a 3 离心10s的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 方法点拨 1 在微量离心管中添加各种试剂时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须更换 以确保实验的准确性 2 离心管的盖子一定要盖严 防止实验中脱落或液体外溢 一 理论上dna扩增数目的计算 1 一条dna 复制n次 dna为2n 2 a条dna 复制n次 dna为a 2n 二 实验中dna含量的测定 1 原理 可以通过计算dna含量来评价扩增的效果 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna的含量有关 三 课题成果评价 2 过程 稀释 2ulpcr反应液 加入98ul蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 计算 取dna稀释液100ul至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 dna含量 g 50 x 260nm的读数 x稀释倍数 50 1 g ml的dna在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0 02 紫外分光度计 比色杯 四 课题延伸 pcr技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出特点 例如 pcr产物每轮循环增加一倍 30轮循环扩增量达230个拷贝 109拷贝 课堂小结 一 pcr原理 1 变性 温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解旋为单链 2 复性 温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 3 延伸 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 二 pcr操作 1 准备 2 移液 3 混合 4 离心 5 反应 pcr过程与细胞内的dna复制过程相比 主要有两点不同 它们是 pcr过程需要的引物是人工合成的单链dna或rna pcr过程不需要dna聚合酶 pcr