抑菌实验步骤.doc

抑菌实验步骤受试菌液浓度的确定： 使用麦氏比浊管校准！0.5单位的麦氏比浊管的配置如下：取0.048mol/L的氯化钡0.5ml，加入到99.5ml的0.18mol/L的硫酸中即可。此比浊管在625nm下吸光度为0.08-0.1之间，相当于10的8此方个菌体浓度！1 配药粗提物高、中、低剂量：50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL2 供试阳性药的制备阿米卡星：无菌条件下，分别吸取1.28mL、0.64mL硫酸阿米卡星注射液于50mL无菌容量瓶中，以pH7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。庆大霉素：无菌条件下，分别吸取3.2mL、1.6mL硫酸庆大霉素注射液于50mL无菌容量瓶中，以pH7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。氯霉素：无菌条件下，分别吸取0.512mL氯霉素注射液于25mL、50mL容量瓶中，以pH6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。头孢曲松钠：无菌条件下，取1.0g注射用头孢曲松钠溶于5mL pH6.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别吸取0.32mL、0.64mL定容于50mL无菌容量瓶中，密封并冷藏保存。以上供试阳性药的有效浓度均为2.56mg/mL和1.28mg/mL。3 供试培养基MH（Mueller-Hinton）培养基（0.6%牛肉膏、1.75%蛋白胨、0.5%氯化钠，pH为7.4）；MHA培养基（0.6%牛肉膏、1.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、1.7%琼脂，pH为7.4-7.6）。4 细菌培养无菌条件下，以移液枪吸取0.01mL菌种于MH培养基内，密封并轻轻摇匀，置37摇床(转速200rmin)中培养16-18h。取直径为90mm灭菌的培养皿，每培养皿倒入20mL熔化并冷却至40左右的MHA培养基，待培养基完全凝固后，用移液枪吸取所需的供试菌悬液0.1mL于培养皿中，用涂布棒涂匀，使菌悬液均匀分布在培养基上。取直径为7mm的圆形滤纸片蘸取供试溶液（完全浸透且无液滴滴落），将该滤纸片均匀摆放在涂有菌悬液的培养基上。每个培养皿中摆放6个纸片，间隔的3个纸片分别为阳性药和供试药的3个不同浓度，重复5次。培养皿用封口膜密封，水平倒置于37培养箱中培养16-18h后，用直尺测量抑菌圈直径的大小。细菌三种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphy lococus aureus)；真菌两种：酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和青霉菌(Penicillium citrinum Thom)、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、桔青霉(Penicillium citrinum)抑菌实验步骤1 配药粗提物高、中、低剂量：50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL2 供试阳性药的制备阿米卡星：无菌条件下，分别吸取1.28mL、0.64mL硫酸阿米卡星注射液于50mL无菌容量瓶中，以pH7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。庆大霉素：无菌条件下，分别吸取3.2mL、1.6mL硫酸庆大霉素注射液于50mL无菌容量瓶中，以pH7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。氯霉素：无菌条件下，分别吸取0.512mL氯霉素注射液于25mL、50mL容量瓶中，以pH6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解定容，密封并冷藏保存。头孢曲松钠：无菌条件下，取1.0g注射用头孢曲松钠溶于5mL pH6.0的磷酸盐缓冲溶液中，分别吸取0.32mL、0.64mL定容于50mL无菌容量瓶中，密封并冷藏保存。以上供试阳性药的有效浓度均为2.56mg/mL和1.28mg/mL。3 供试培养基MH（Mueller-Hinton）培养基（0.6%牛肉膏、1.75%蛋白胨、0.5%氯化钠，pH为7.4）；MHA培养基（0.6%牛肉膏、1.75%蛋白胨、0.5%氯化钠、1.7%琼脂，pH为7.4-7.6）。4 细菌培养无菌条件下，以移液枪吸取0.01mL菌种于MH培养基内，密封并轻轻摇匀，置37摇床(转速200rmin)中培养16-18h。取直径为90mm灭菌的培养皿，每培养皿倒入20mL熔化并冷却至40左右的MHA培养基，待培养基完全凝固后，用移液枪吸取所需的供试菌悬液0.1mL于培养皿中，用涂布棒涂匀，使菌悬液均匀分布在培养基上。取直径为7mm的圆形滤纸片蘸取供试溶液（完全浸透且无液滴滴落），将该滤纸片均匀摆放在涂有菌悬液的培养基上。每个培养皿中摆放6个纸片，间隔的3个纸片分别为阳性药和供试药的3个不同浓度，重复5次。培养皿用封口膜密封，水平倒置于37培养箱中培养16-18h后，用直尺测量抑菌圈直径的大小。细菌三种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphy lococus aureus)；真菌两种：酵母菌(Saccharomyces cerev