基于碳纳米管的杂色曲菌素电化学传感器电极的构建和性能研究.doc

暨南大学硕士学位论文题名：基于碳纳米管的杂色曲菌素电化学传感器电极的构建和性能研究Fabrication and Study of Performance of VersicolorinA ElectrochemicalSensor Electrode Based on CNTs作者姓名：张红英指导教师姓名：刘大岭及学位、职称：教授姚冬生教授学科、专业名称：生物化学与分子生物学论文提交日期：2014年 5月论文答辩日期：2014年 6月 6日答辩委员会主席：苏晓鸥研究员论文评阅人：邹小勇教授 鲁志松教授学位授予单位和日期：暨南大学 2014年 6月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： 导师签名：签字日期：签字日期：年 月 日年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：邮编：通讯地址： 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究摘要目的：黄曲霉毒素是一类具有强致癌性、致畸性和遗传毒性的真菌毒素。是污染粮食和饲料的主要毒素之一，对人和家禽家畜的危害极大。其中黄曲霉毒素 B1（AFB1）毒性最大，污染也最为普遍。杂色曲菌素（Ver A）是 AFB1生物合成途径中重要的前体物，与AFB1的生物合成密切相关。前期研究表明 Ver A能够作为监测仓储粮食黄曲霉毒素污染的预报性的生物指示物。建立快速灵敏简单的 Ver A检测方法具有重要意义。电化学传感器具有成本低廉，操作简便，检测快速，灵敏度高，不用繁琐的样品前处理，可以实时监控以及易微型化等优点。本文拟建立检测 Ver A的电化学传感器方法。方法：通过培养寄生曲霉突变株来产生 Ver A，得到 Ver A标准品，并通过质谱对其进行鉴定后作为检测底物。修饰电极的构建通过自组装技术将半胱胺（CSm）和单壁碳纳米管（SWCNTs）组装到金电极上。优化了修饰电极的构建方式，用原子力显微镜、扫描电镜、循环伏安法和交流阻抗法对其进行了表征,并对构建的传感器进行了性能评价。结果：（1）分离纯化得到 Ver A标准品 3.0mg。（2）确定了检测 Ver A的电化学传感器的构建方式为 SWCNTs/CSm/Au。（3）获得的传感器对 Ver A的检测表现出较好的性能：检测线性范围为 1001200ppb，检测限为 75ppb（3SD/slope），灵敏度为 0.30A.ng-1.ml.cm-2，以及常见的电活性物质对其不产生干扰。组装的电化学传感器具有较好的重现性和稳定性，相同条件下重复检测 400ppb的 Ver A 12次，响应电流的 RSD为 4.6%；同批制作 7根修饰电极检测350ppb的Ver A，RSD为4.2%；放置30天后，其响应电流为初始值的98.2%。当用于加标玉米样品检测时，加标回收率在 95.5%111.8%之间，RSD在 1.1%6.2%之间。结论：建立了杂色曲菌素传感器电极的组装方法，杂色曲菌素的传感器检测法具有响应迅速、设备简单、无需复杂的样品预处理的特点。关键词：电化学传感器；单壁碳纳米管；杂色曲菌素；快速检测I 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究AbstractObjective: Aflatoxins (AFs) are one group of the most potentially carcinogenic, teratogenicand genotoxic substances. AFs are found to be one of the predominant mycotoxins incontaminating food and feed. They are seriously harmful to humans, livestock and poultries.Among them afltoxin B1 is the most toxic and commonly contaminant. VersicolorinA (Ver A) isan important precursor of AFB1 biosynthetic pathway. And it is closely related to thebiosynthesis of AFB1. Previous investigation indicated that Ver A is a feasible predictivebioindicator for aflatoxins-contamination of storage-crops. Therefore, to establish a rapid,sensitive and easy method for Ver A detection is important. Electrochemical sensors have theadvantages of such as low cost, simple operation, rapid response, high sensitivity, withouttedious sample pre-treatment. The sensors are potentially developed to be real-time monitoring,miniaturize and portable. Thus, in this thesis, an electrochemical sensor for Ver A wasconstructed. And a sensor way of Ver A detection was set-up.Methods: Ver A standard was prepared from a mutant of Aspergillus parasiticus andidentified by mass spectrometry. The sensor was constructed by self-assembly technique.Cysteamine (CSm) and single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) were assembled onto thegold electrode with step-by-step optimization. The surface of the constructed sensor was viewedwith atomic force microscopy. The processes of caroxylation SWCNTs and sensorsconstructions were monitored by infrared spectroscopy, cyclic voltammetry and electrochemicalimpedance spectroscopy.Results: (1) Three-milligram of Ver A standard was obtained. (2)The optimized way to buildthe Ver A sensor was found to be SWCNTs/CSm/Au. (3)The final obtained Ver A sensor showedacceptable performances including of a wide linear range from 100ppb to 1200 ppb, a detectionlimit of 75ppb (3SD/slope), a sensitivity of 0.30A.ng-1.ml.cm-2 with a good selectivity to thegeneral electroactive interferences. The presented Ver A electrochemical sensor had theadvantage of a good repeatability. Under same conditions, the RSD of 12 replicatedeterminations of 400ppb Ver A was 4.6%. Seven one-patch-made electrodes showed a 4.2% ofRSD of 350ppb Ver A detection. The Ver A-sensor was stable, it remained 98.2% of theII 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究original current value after a 30-day of storage at 4. After a simple preparation of 80%methanol extraction, the sensor-way of Ver A detection for standard samples (6 corn-powders)had giving acceptable recovery values from 95.5% to 111.8% with RSD in the range of1.1%6.2%.In conclusion: In this thesis, the assembling method of the Ver A sensor electrode wasestablished. The present sensor was easy to operate in Ver A detection, without the sophisticatedpreparation processes.Key word： electrochemical sensor; Single-walled carbon nanotubes; Versicolorin A;Fast-detectionIII 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究目录摘要.IAbstract. II目录.IV英文缩略词.IX1绪论.11.11.21.3黄曲霉毒素简介.1霉菌毒素的生物指示物.1杂色曲菌素简介.21.3.1杂色曲菌素的理化性质.2杂色曲菌素的毒性及其检测方法.31.3.21.41.5生物传感器简介.41.4.1生物传感器概述.4酶生物传感器.41.4.2无酶电化学传感器.51.5.1无酶电化学传感器简介.5无酶电化学传感器的优势.6无酶电化学传感器取得的研究成果.7无酶电化学传感器的前景.81.5.21.5.31.5.41.61.71.81.91.10碳纳米管.8研究背景、目的及意义.12研究的主要内容.13本研究的创新性.14技术路线.152Ver A标准品的制备.16实验设备与材料.162.12.1.1实验设备.16IV 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究2.1.2实验材料.162.22.32.4实验方法.182.2.1寄生曲霉突变株的培养.18Ver A的提取.18制备型 TLC板初步分离 Ver A.18半制备 HPLC精制纯化 Ver A .19制备的 Ver A的 TLC分析 .19制备的 Ver A的 MS鉴定.20Ver A的纯度分析.202.2.22.2.32.2.42.2.52.2.62.2.7实验结果.202.3.1寄生曲霉突变株的培养.20Ver A的提取.21制备型 TLC板初步分离 Ver A.22半制备 HPLC精制纯化 Ver A .22制备的 Ver A的 TLC分析 .24制备的 Ver A的 MS鉴定.24Ver A的纯度分析.252.3.22.3.32.3.42.3.52.3.62.3.7本章小结.26Ver A电化学传感器电极构建方式的优化.2733.1实验设备与材料.273.1.1实验设备.27实验材料.27主要的溶液.283.1.23.1.33.2实验方法.293.2.1循环伏安法.29交流阻抗法.29微分脉冲伏安法.30线性扫描伏安法：.303.2.23.2.33.2.43.3实验步骤.30V 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究3.3.13.3.23.3.33.3.43.3.53.3.63.3.73.3.83.3.93.3.103.3.113.3.12金电极的打磨和清洗.30碳纳米管的选择.30单壁碳纳米管的纯化和羧化及红外光谱表征.31单壁碳纳米管的透射电镜观察.31羧化的 SWCNTs修饰电极.32SWCNTs滴涂在电极表面干燥温度的优化.32组装 SWCNTs浓度的优化.33自组装单分子膜法（SAMs-SWCNTs）修饰电极的优化.33修饰电极的表面积.34修饰电极各组装过程的特性表征.35Ver A传感器电极的构建方式.36SWCNTs/CSm/Au组装过程中不同电极对 Ver A的响应性能 .363.4实验结果.373.4.1金电极的打磨和清洗.37碳纳米管的选择.37单壁碳纳米管的纯化和羧化及红外光谱表征.39单壁碳纳米管的透射电镜观察.40羧化的 SWCNTs修饰电极.41SWCNTs滴涂在电极表面干燥温度的优化.43组装 SWCNTs浓度的优化.45自组装单分子膜法（SAMs-SWCNTs）修饰电极的优化.46修饰电极的表面积.50修饰电极各组装过程的特性表征.51Ver A传感器电极的构建方式.57SWCNTs/CSm/Au组装过程中电极对 Ver A的响应性能 .583.4.23.4.33.4.43.4.53.4.63.4.73.4.83.4.93.4.103.4.113.4.123.5SWCNTs/CSm/Au传感器电极检测 Ver A条件优化及其性能评价 .60实验设备与材料.60本章小结.5944.14.1.1实验设备.60VI 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究4.1.24.1.3实验材料.60主要的溶液.614.24.3实验方法.614.2.1循环伏安法.61微分脉冲伏安法.624.2.2实验步骤.624.3.1检测 Ver A条件的优化.62SWCNTs/CSm/Au传感器电极对 Ver A的响应性能测定 .63SWCNTs/CSm/Au传感器电极的抗干扰性 .63SWCNTs/CSm/Au传感器电极对 Ver A响应信号的重现性 .63SWCNTs/CSm/Au传感器电极的制作重现性 .63SWCNTs/CSm/Au传感器电极的存储稳定性 .644.3.24.3.34.3.44.3.54.3.64.4实验结果.644.4.1检测 Ver A条件的优化.64SWCNTs/CSm/Au传感器电极对 Ver A的响应性能测定 .67SWCNTs/CSm/Au传感器电极的抗干扰性 .68SWCNTs/CSm/Au传感器电极对 Ver A响应信号的重现性 .69SWCNTs/CSm/Au传感器电极的制作重现性 .70SWCNTs/CSm/Au电极的存储稳定性 .704.4.24.4.34.4.44.4.54.4.64.5SWCNTs/CSm/Au电极检测玉米样品中的 Ver A .72本章小结.7155.15.25.3实验设备与材料.725.1.1实验设备.72实验材料.725.1.2实验方法.735.2.1回收率的测定.73实际玉米样品中 Ver A的检测.735.2.2实验结果.745.3.1回收率的测定.74VII 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究5.3.2实际玉米样品中 Ver A的检测.755.4本章小结.756总结讨论与展望.76参考文献.78攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况.89致谢.90VIII 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究英文缩略词SWCNTsMWCNTsVer AAFsSingle-walled carbon nanotubes单壁碳纳米管多壁碳纳米管杂色曲菌素Multi-walled carbon nanotubesVersicolorin AAflatoxin黄曲霉毒素AFB1CSmCSAflatoxin B1黄曲霉毒素 B1半胱胺CysteamineChitosan壳聚糖HRPHorseradish peroxidaseAtomic force microscopyScanning electron microscopeTransmission electron microscopeFourier transform infrared spectrometerCyclic voltammogramLine sweep voltammetryDifferent pulse voltammogramN-Hydroxysuccinimide辣根过氧化物酶原子力显微镜扫描电子显微镜透射电子显微镜傅里叶红外光谱仪循环伏安法AFMSEMTEMFT-IRCVLSV线性伏安扫描微分脉冲伏安法N-羟基丁二酰亚胺DPVNHSEDCN(3-dimethylaminopropyl)-N-ehyl-car 1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙bodiimid hydrochlorid基)-碳二亚胺IX 暨南大学硕士学位论文基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究1绪论1.1黄曲霉毒素简介黄曲霉毒素（AFs）是一种毒性极强的霉菌毒素且具有高致畸性和高致突变性，其在谷物，花生，玉米，棉籽粕、豆粕等中普遍存在，在田间和仓储过程中均能生成黄曲霉毒素。由于其性质稳定，一般的加工方法很难将其去除或灭活。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）划定为I类致癌物，对人和家禽家畜危害极大，各个国家都对黄曲霉毒素在食物中的含量进行了严格的限定，其中黄曲霉毒素 B1