支气管肺泡灌洗(BAL)的临床应用与实验室检查.doc

支气管肺泡灌洗(BAL)的临床应用与实验室检查 一定义：支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage,BAL）是一种经纤维支气管镜获取肺泡的细胞与生化成份的广为实用而安全的方法。注意:BAL的操作规范BAL灌洗液的处理规范BAL的非细胞成份指标尚不能作为有用的临床参考二用途：l 疾病诊断：特异性诊断；重要诊断工具。l 疗效与预后评价l 治疗l 研究 对于某些特殊疾病，BAL可以做出特异性的诊断 l 机会性肺部感染：卡氏肺囊虫性肺炎，巨细胞病毒性肺炎，肺结核，肺真菌感染l 尘肺，石棉肺，肺出血l 铍肺（阳性淋巴细胞转换试验） l 支气管肺泡细胞癌，恶性淋巴瘤等（肿瘤细胞）l 肺泡蛋白沉着症（对氨基水扬酸阳性小体）l 组织细胞增多症 X (Histiocytosis X) 对于一些间质性肺病，BAL是重要诊断手段结节病，外源性过敏性肺泡炎，闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎（BOOP），特发性肺纤维化(IPF)，慢性嗜酸细胞肺炎等。三应用指征1. 间质性渗出改变：结节病，外源性过敏性肺泡炎，药物性肺泡炎，特发性肺纤维化，胶原血管疾病，组织细胞增多症 X，尘肺，癌性淋巴管炎等。2. 肺泡渗出改变：肺炎，肺泡出血，肺泡蛋白沉着症，BOOP，嗜酸细胞肺炎等3. 免疫缺陷病人并肺渗出病变：HIV感染，化疗或放疗，免疫抑制剂治疗，器官移植四BAL副反应：发生率为0-2.3%，当同时进行经支气管镜肺活检(TBLB)，副反应为7%，尚无因 BAL死亡报道，因TBLB死亡0.2%，因开肺活检(OLB)死亡1.8%。1. 副反应发生形式与时间肺泡渗出50%的肺野渗出实变PaO260mmHgl SaO290%，支气管反应性PC202ug/ml乙酰甲胆碱l FEV160%预计值，或FEV11LProthrombin time50%l 血小板计数低于20,000/ml 明显异常的ECGl 对镇静剂敏感或不能耐受 严重的伴发症PC20：FEV1降低20%所需的最低乙酰甲胆碱浓度 五操作绝大多数在局麻下使用纤维支气管镜进行。BAL总是在其它纤支镜操作之前，以免造成BAL的不纯。1. 操作前用药：l 镇静剂: 以便病人合作；l 胆硷能受体抑制剂：减低迷走反射，支气管分泌，可增加BAL回吸收。2. 局部麻醉：必须彻底，防止咳嗽，因咳嗽致损伤，出血及灌洗液丢失。但进行BAL前应将利多卡因吸走以免影响细胞回收，活性及功能。3. 灌洗部位：常规为右中叶，左舌叶。中叶易于操作及嵌顿，回收的BAL较灌洗下叶多20%；对于大多数弥漫性间质性肺病病人，一个部位灌洗应该能代表全肺并能提供足够的临床资料；局部病变如肿瘤，炎性渗出等需行局部病变部位灌洗。4. 灌洗液：无菌生理盐水，370C或室温。5. 灌注和回收方法：20-50ml次，总量100-300ml肺段。临床上较实用而安全的灌洗量：5x20ml。6. 回收方法：每次灌注后立刻经朔料注射器手动回抽或吸引器低压轻轻吸引(25-100mmHg)；通常回吸收40-70%， 25%时，BAL不可靠；回收的液体必须收集在朔料或硅化的注射器或容器内，防止巨噬细胞附着；可借助于导管进行灌注，嵌顿后将导管从活检孔送至支气管镜尖端，再行灌注有利于注射器的变化，同时降低死腔。7. BAL操作关键：局麻充分；防止病人咳嗽；无急性支气管炎；支气管镜嵌顿。六液的实验室处理1 细胞计数与活性1) 所有回收液经两层纱部过滤，移去粘液，充分混匀（若使用20ml次， 因第一管回收的液体及细胞占总量比例很小，计入总量内，对结果影响不大）。2) 观测性状，测定液体量如BAL液呈混浊奶白色，提示肺泡蛋白沉着症，需进行PAS染色，电镜检查。如BAL液呈橘黄色，提示出血，需行铁染色。3) 离心1500rpm x 10minl 上清液保存在-800C冰箱， 以作生化成份分析。至目前为止，尚无一个可靠的参考定量标准故尚无法用于临床。l 细胞沉淀用2mlMBE充分混匀后，等分装在两个eppendorf管内，1管用作细胞分类计数，另1管用作细胞免疫分析。* 如果是血性，需先进行梯度离心分离淋巴细胞，加1ml Ficoll液于前述留作细胞免疫 分析用的1ml细胞悬液的底部，梯度离心3000rpmx3min+2000rpmx5min，让离心机慢慢减速而停止小心吸取细胞环，用2ml悬浮，洗涤。 * 如怀疑石棉肺：则先混匀所有回收液（过滤离心前），从中取出10ml+30ml蒸馏水混匀，室温静置约一小时，破坏细胞，有利于被巨噬细胞吞噬的石棉小体释放。轻轻摇晃，经石棉小体过滤装置(Millipore)真空过滤，过滤后，0.45um微孔膜空气干燥，注意避免打折小心转移滤膜至圆形玻片上，用Histokitt封片因用Histokitt封片后，亮度足够镜下观察，故没有必要用丙酮溶解滤膜。光镜（10x或40x）下计数整张滤膜上的所有石棉小体被过滤的BAL毫升数（如10）除，得结果：石棉小体数/mlBAL4) 细胞总数与活性测定l 细胞总数: 10ul上述细胞混悬液 + 200ml Turck 溶液，充分混匀，取适量填充于血细胞计数板内计数或采用自动计数仪计数。血细胞计数板（Neubauer cell chamber)数四角大方格（16 x 4 个小方格）内细胞数，计算公式为：细胞总数 = 细胞数 x 52.5(计数板溶积）x 2000ul（含所有细胞） 106 = 细胞数 x 0.105 = ? (x 106细胞)l 细胞活性: 50ul上述细胞混悬液 + 10ul台盼蓝（Typan blue）溶液，充分混匀，取适量填充于血细胞计数板内，5-10分钟内计数100个细胞内存活细胞的百分率，死细胞染成蓝色。通常于320倍放大下计数。通常活性在80-95%, 50 %细胞活性，细胞形态及功能明显受影响。2. 细胞分类检查：1) 细胞涂片方法：l 常规手推片：简单，能适用于大多数需要，尤其适应于要进行肿瘤细胞鉴定的BAL及血性BAL将上述留作细胞学检查的细胞混悬液离心后进行涂片，空气干燥。合格涂片细胞密 度适当，细胞分布均匀。l 细胞离心涂片：每张片5-20x104细胞。细胞保存液，离心速度，时间均可影响细胞分类。细胞离心涂片降低淋巴细胞分类。当细胞总数1x106时，通常采用细胞离心涂片，当细胞总数1x106时，经验稀释法如下：细胞总数 (x106)细胞悬液+MBE106细胞/ul进行点吸涂片，取一滴（约10ul）细胞液滴于玻片，即刻回吸，形成一细胞圈；重复上述操作，做成四个细胞圈排列于玻片一端，空气干燥。* 每份BAL样本通常做3张涂片，一张做普通染色，另二张备做特殊染色。 当怀疑机会性肺部感染，需做抗酸染色，甲苯胺蓝染色时，应加做点吸涂片二张2) 细胞染色：l 常规染色（供做细胞分类）：May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色l 特殊染色：Fe染色（Berlin blue stain）PAS染色，过碘酸雪弗染色（Periodic acid Schiffs stain)甲苯胺蓝染色（Toluidine stain）苏丹染色，脂肪染色（Sudan III stain）抗酸染色（Ziehl-Neelsen stain for acid-fast bacilli stain）3) 细胞分类计数：l 染色涂片于光学显微镜下观察，计数至少个白细胞求分类百分比。l 半定量估计上皮细胞，红细胞，如上皮细胞5%提示支气管成份的混入。l 另外观察细胞形态，巨噬细胞内吞噬体，尘粒，石棉小体，红细胞片段，CMV包含体，卡氏肺囊虫（PCP），细菌，霉菌，异形上皮及肿瘤细胞。3. 免疫细胞学分析l 免疫细胞化学法，如过氧化酶抗过氧化酶反应l 免疫荧光或流式细胞仪分析(Immunofluorescence or flow cytometry)免疫荧光优点：流式细胞仪自动测定，双标计有利于研究两种不同表面抗原的平行表达 免疫荧光缺点：非参数计录，非细胞形态显示，巨噬细胞的自动荧光干扰 免疫化学方法优点：光学显微镜，永久保存，形态学观察，敏感性高 免疫化学方法缺点：虽双标记可能，但耗时间4. 过氧化酶抗过氧化酶方法(perioxidase-antiperioxidase method)是进行细胞免疫分析常使用的方法。优点：所需细胞少，20,000细胞反应区，所需用抗体少细胞形态保存好(因为避免了干燥，离心，丙酮固定，因此优于经空气干燥的细胞离心涂片所进行的免疫化学染色)1) 细胞的准备：l 将前述留作免疫细胞分析的细胞用洗3次，离心1500rpmx3minl 再用洗3次，离心1500rpm x 3minl 稀释至适当的细胞浓度，一般10x106/ml，若巨噬细胞多，使用二倍MEM稀释，若淋巴细胞细胞多，使用1/2倍MEM稀释2) 细胞附着：l 吸附玻片用温水洗去绿色保护层，再用溶液冲洗（注意不要损坏反应区带正电的薄膜，因其吸附带负电的细胞）。l 将混匀的细胞悬液10ul(20,000细胞) 加于每个反应区，显微镜下监控细胞密度如细胞层过厚，需进一步稀释，如太薄，需加更多细胞细胞于湿合内室温下静置10分钟， 防止细胞干燥。3) 细胞固定：l 真空吸去MEM，加10ul 0.05%戊二醛于每个反应区，让其反应 5 分钟，吸走固定液，用NKH洗三次。（固定有利于细胞形态保存， 细胞附着，阻止细胞表面的Fc受体）。4) 加10ul准备好的MAG-Sweine于每反应区，震荡浮化15分钟，吸走MAG-Sweine。（以避免免疫球蛋白连接于玻片表面）5) 加特异的单克隆抗体10ul，震荡浮化15分钟。* 到此，反应可以斩停，细胞片放于40C冰箱保存。6) 过氧化酶抗过氧化酶反应：* 用NKH喷雾清洗多于抗体，相继先后在三个盛有NKH的玻璃器皿内漂洗3次，仔细从侧边吸走过剩的NKH。l 加10ul准备好的RAM到每个反应区， 于震荡器上震荡浮化5分钟，用NKH清洗玻片同上述。l 加10ul准备好的SAR溶液于反应区，于震荡器上震荡浮化5分钟，用NKH清洗玻片同上述。l 加10ul准备好的PAP溶液于每反应区，震荡浮化5分钟，同前用NKH清洗后，再让玻片留于第三瓶NKH内震荡清洗5分钟。7) DAB反应：l 移去过度的NKH，加DAB 10ul于每反应区，反应10分钟，用NKH喷雾洗去DAB，再将玻片放于新鲜的NKH溶液钟震荡清洗5分钟。（注意：DAB是致癌物，需保护性操作，一定要在排风装置下，戴口罩，手套操作，DAB废物特殊存放，特殊处理）8) Osmium反应：l 移走多余的NKH，加10ulOsmium于每反应区，置于湿合内于冰上反应10分钟进行后固定，用蒸馏水清除过剩的Osmium，玻片短时置于蒸馏水的器皿中。（注意：Osmium是有毒物，需保护性操作，一定要在排风装置下，戴口罩，手套操作，Osmium废物特殊存放，特殊处理）9) 封盖玻片：l 移走过量的蒸馏水，滴玻片覆盖液适量，加盖玻片，轻轻挤压移去多量覆盖液，不要留气泡，不要挤压细胞，清洗表面，轻轻试干，用无色指甲油封片。10) 光学显微镜下计数至少200个淋巴细胞或巨噬细胞（包括阳性和阴性细胞），求出阳性反应细胞的百分率。5. 细胞染色方法1) May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色:l 空气中凉干的细胞涂片于浓缩的 May-Grunwald溶液中染色3-5分钟l 蒸馏水短时冲洗l 1:100 Giemsa蒸馏水混合液中染色15分钟l 自来水短时冲洗，空气中凉干，加Histokitt封片2) Fe染色（Berlin blue染色）：注意：禁止使用含Fe的镊子和容器l 空气中凉干的细胞涂片于纯甲醇(methanol)中固定5分钟l 配制Potassium Hexacyanoferrate II溶液：1g Potassium hexacyanoferrate II 3H2O +100ml蒸馏水 +1ml 37% HCL（盐酸加入使之易氧化，由无色清亮变为绿色,特殊废品处理）l 玻片于新鲜的Potassium Hexacyanoferrate II溶液中作用8分钟l 于Mayer氏苏木精明矾（Mayers haemalaun）染液中染色2-5分钟（染核）l 蒸馏水中清洗最多10分钟显蓝色l 空气干燥，滴玻片覆盖液如Histokitt，加盖玻片。3) 甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色：l 点吸细胞涂片空气干燥至少半小时l 准备醋酸硫酸混合液：30ml浓醋酸(concentrated acetic acid)+10ml浓硫酸(concentrated sulphic acid)使用前冷却10分钟l 细胞涂片放于准备好的醋酸硫酸混合液中浮化5分钟，轻轻摇晃至少 3次，以促进细胞更好溶解。l 自来水流动清洗5分钟l 甲苯胺蓝瓶中封盖染色5分钟l 自来水流动清洗3分钟l 玻片先后在96%和100%乙醇(ethanol)中浸蘸约10秒l 空气干燥，滴玻片覆盖液如Histokitt，加盖玻片染色l 涂片空气干燥至少2小时l 蒸馏水短暂冲洗l 玻片于过碘酸(periodic acid)溶液中浸泡5分钟l 蒸馏水短暂冲洗l 放玻片于Schiffs试剂中10分钟l 蒸馏水短暂冲洗l 放玻片于SO2水中5分钟l 蒸馏水短暂冲洗l Mayers haemalaun染液中30秒对照染色l 自来水中清洗5分钟至显蓝色l 蒸馏水短暂冲洗l 玻片先后于96%和100%乙醇各5秒钟脱水l 空气中凉干，加Histokitt封片SO2水配制： 0.6 g Na-disulphite+ 100ml自来水+ 5ml 1N HCL4) Sudan III染色（脂肪染色）l 细胞涂片空气干燥至少半小时l 蒸馏水中短暂浸蘸，50%乙醇(ethanol)中固定5分钟l Sudan III溶液中封盖染色30分钟l 50%乙醇(ethanol)中固定10秒，蒸馏水短暂冲洗l Mayers haemalaun染液中5分钟对照染色l 蒸馏水中清洗5分钟至显蓝色，空气中凉干，加Histokitt封片5) 抗酸染色：l 手推细胞涂片或点吸涂片空气中干燥至少半小时，加热固定l 玻片用浓缩的石炭酸品红液(carbolfuchsin)覆盖，加热蒸发过多染料至少5分钟l 自来水冲洗，玻片用盐酸酒精(HCL-alcohol)彻底脱色l 用自来水冲洗，美蓝（Methylene blue）对照染色至多45秒l 自来水冲洗，空气中凉干，加Histokitt封片6) 肥大细胞染色：l 细胞涂片空气中干燥至少1小时，10分钟固定l 固定液组成：50ml纯酒精（100% ethanol）+40ml氯仿（chloroform）+10ml醋酸（acetic acid）l 自来水流动冲洗5分钟l 甲苯胺蓝(Toluidine blue)溶液中染色20分钟l 自来水流动冲洗5分钟l 在96%乙醇（ethanol）中浸蘸2次，空气中凉干，加Histokitt封片6. 试剂配制1) 正常人血清(AB serum)分离非抗凝血于560C浮育30分钟40C冰箱静置2小时，离心5000rpmx20min分离的血清按200ul分装，置于-200C冰冻保存2) 兔抗鼠免疫球蛋白原液（rabbit anti-mouse, RAM stock solution) 1:5050ul兔抗鼠免疫球蛋白（RAM）+200ul正常人血清（AB serum）+200ul猪血清（swine serum）+2500ul MAG40C冰箱储存可用二周3) 猪抗兔免疫球蛋白（swine anti-rabbit, SAR）50ul猪抗兔免疫球蛋白（SAR）+100ul人血清（AB serum）40C冰箱孵化至少一天后待用，可存放4周4) DAB(排风装置下，戴口罩，手套操作）0.5 g DAB+50ml NKH (无Hepes，无酚红）+5ml Hepes (pH 8.0)+2ml明胶（gelantine）370C加热溶化混合后，按2ml分装，置于-200C保存DAB使用液：2ml DAB + 20ul 3%H2O2DAB-PAP探针试验: 5ul PAP + 50ul DAB反应显棕色，40C冰箱保存可使用二天。5) Osmium(排风装置下，戴口罩，手套操作）250mg Osmium+100ml Sorensen-PBS (0.1M/L,pH 7.4)避光封装，40C冰箱保存6) Latex1000ul MEM（应用液）+ 50ul 22%BSA + 5ul Latex溶液于370C水浴预热15分钟7) 细胞转送液50ml MEM（应用液）+2.5ml 22%BSA8) 抗体各种冻干抗体按说明溶解分装：20ul抗体液+10ul液体石蜡，-200C冰冻保存应用时，抗体室温解冻后，用MAG进行稀释，稀释倍数因抗体而异，如 1:50或1:1009) 盐酸酒精溶液（HCL-alcohol)270ml蒸馏水 +700ml酒精 +30ml 37%HCL10) 过碘酸溶液（Periodic acid solution）3.75 g过碘酸（H5IO6)+500ml蒸馏水11) 甲苯胺蓝(Toluidine blue)溶液0.15 g甲苯胺蓝0(Toluidine blue 0)+30ml蒸馏水+70ml纯乙醇（100% ethanol）+1ml 37%HCL12) Sudan III溶液1 g Sudan III +100ml 70%乙醇(ethanol)于350C水浴震荡溶解，冷却后过滤，避光保存13) MAG(M=MEM, A=Albumin, G=Gelatine)50ml浓缩MEM+2ml Hepes (pH 8.0)+500ul 22%BSA（牛血清白蛋白）+2ml 5%Gelatine（明胶）（需水浴溶化）+500ul 10%NaN3（叠氮钠）（有害物，注意保护性操作）配制好的MAG于40C冰箱保存可用一周左右14) 5% EDTA5 g Titriplex III先用70-80ml NKH(无Hepes，无酚红， pH4-5)溶解，用NaOH调节pH为7.4，用同上NKH配成100ml40C冰箱保存可达4-8周。15) 05%戊二醛(glutaraldehyde)200ul 25%戊二醛（有毒性）+100ml Soerensen PBS (pH 7.8)+2.5ml 40%葡萄糖 40C冰箱保存16) 5%明胶(Gelatine)5 g明胶先用80ml蒸馏水于500C溶解，加1ml NaN3，用1N NaOH调节pH至7.4，用蒸馏水配成100ml，按2ml分装，40C冰箱保存17) 1M/L Soerensen磷酸缓冲液，Soerensen PBS（Soerensen phosphate buffer)3.4 g KH2PO4+250ml蒸馏水7.7 g Na2HPO4+500ml蒸馏水加磷酸二氢甲溶液（0.1M/L)到磷酸氢二钠溶液至所需要的pH值（如pH7.8，加约87ml)*pH 7.4为配制Osmium和玻片覆盖液准备*pH7.8为配制戊二醛准备分装，-200C冰冻保存18) Hepes缓冲液1M/L23.83 gHepes先用80ml蒸馏水溶解用1M/L NaOH调节pH至7.4或8.0，用蒸馏水配成100ml*Hepes pH7.4为配制NKH溶液准备，Hepes pH8.0为配制MEM使用液准备19) 免疫细胞片覆盖液(cover solution)80ml甘油（Glycerin）+15ml Soerensen PBS (0.1M/L，pH 7.4)+5ml 25%戊二醛(glutaraldehyde) (毒性，排风装置下操作)20) 需每天新鲜配制的应用液a) MEM (minium essential medium)应用液5ml浓缩MEM2ml Hepes (pH8.0)加蒸馏水配制成50mlb) MBE (M=MEM, B=BSA, E=EDTA)30ml MEM应用液250ul 22%BSA（牛血清白蛋白）600ul 5%EDTAc) NKH (N=Natriumchlorid, K=Kaliumchlorid, H=Hepes)8 g NaCL0.4g KCL1L蒸馏水溶解，加1ml Hepes pH7.4，加400ul酚红使其显淡粉色d) Sandwichesl M + S (MAG + Swine serum)：100ul猪血清+1000ul MAGl RAM (Rabbit anti-mouse immunoglobulin)应用稀释液1:250200ul人血清200ul RAM原液1:50600ul MAGl SAR (Swine anti-rabbit immunoglobulin)150ul经40C冰箱孵化的SAR与人血清混合液(50ul SAR+100ul人血清)+1000ulMAGl PAP (rabbit peroxidase anti-peroxidase immunocomplex)50ul PAP+1000ul MAG7. 试剂与器材acetic acid 100%醋酸acetone丙酮Adhesion slides with 12 reaction squares per slideBSA 22%,Beef serum albumin牛血清白蛋白Carbolfuchsin solusion石炭酸品红液DAB, diaminobenzidine联苯胺Ethanol (95%, 100%)乙醇FicollGelatine明胶Giemsa吉姆萨染剂Glucose 40%葡萄糖Glutaraldehyde 25%戊二醛Glycerine甘油HCL 37%Hepes buffer (pH 7.4, 1M/L)HistokittHuman serum AB serum人血清H2O2 30%过氧化氢Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate(C6FeK4N6 3H2O, M=422.41g/mol)KCLKH2PO4Loflers methylene blue吕弗勒氏亚甲蓝Mayers haemalun苏木精明矾May-Grunwald solutionMEM (10x),minium essential mediumMethanol甲醇NaCLNa2HPO4NaN3(sodium azide)叠氮钠NaOHOsmium (OsO4)俄PAP, peroxidase antiperoxidasePeriodic acid (H5IO6)过碘酸Phenol red酚红RAM, Rabbit anti-mouseSAR, Swine anti-rabbitSchiffs reagentSodium disulphiteSulphuric acid (95-97%)硫酸Swine serumSudan IIITitriplex III (C10H14N2Na2O8 2H2O)Toluidine blue甲苯胺蓝Trypan bleu台盼蓝(C34H24N6Na4O14S4), 0.5% W / V in NSTurcks solution, acetic acid gentian violet solution醋酸龙胆脂液Latex, Latex beads, Polystyrene乳胶RPMI 1640L-GlutaminePenicillin/Streptomycin配有排风装置的实验操作台冰箱满足不同的温度要求如40C，-200C，-700C震荡器Agitator(Heidolph Reax3)台式离心机适应于eppendorf管离心机适应于不同规格管的需要如2ml，10ml，50ml细胞离心机(Cytospin)微量加样器不同规格及匹配的吸头 (5ul, 10ul, 20ul, 50ul, 100ul, 200ul, 400ul, 500ul, 1000ul)微量加样器支架Multi-pipettes(to give 10ul aliquots)及匹配的吸管微量天瓶震荡水浴pH测定仪细胞分类计数器光学显微镜真空水泵倒置显微镜Eppendorf管及支架50ml Falcon管血细胞计数板(Neubauer cell chamber)滴定烧瓶100ml, 500ml, 1000ml朔料瓶，带喷雾头湿合纱布吸附片玻璃实验器皿DAB废物瓶，Osmium废物瓶0.45um微孔膜，匹配玻片石棉小体过滤装置细胞培养所需部分相关材料消毒吸管及 Pipette vibrator细胞培养盘消毒Eppendorf tips, Eppendorf tubes消毒50ml Falcon tubes消毒纱布低温离心机CO2培养箱Lipopolysaccharide(LPS)Herbimycin ADexamethosonePentoxifyllineAnti-CD14 Anti-FasRAnti-TNFR1Anti-TNFR2Anti-Fas ligandELISA kits for sFasR, sTNFR1, sTNFR2, bcl-2, TNF-, IL-1,IL-6, Il-8, IL-10, etcAnnexin V-FITC kit detecting early phase of apoptotic cellsApoptosis in-situ kit*免疫荧光分析Analysis by immunofluorescene用Hanks液洗细胞悬浮于RPMI-1640中，调节浓度10x106细胞/ml细胞活性95%100ul细胞悬液(1x106细胞)和适量的fluorescein-isothiocyanate, FITC, 绿色，phytoerycerin, PE，红色连接的抗体孵化30分钟对照：不加抗体孵化后，用2ml冷Hanks液洗3次，离心300gx10min间接方法：加免疫标记的抗鼠免疫球蛋白（包括对照），孵化30分钟， 用2ml冷Hanks液洗3次，离心300gx10min直接方法：对照：同型非特异单克隆抗体悬浮细胞荧光显微镜下计数阳性细胞百分率注：巨噬细胞可以有自身免疫荧光，尤其在吸烟着双标记免疫分析流式细胞仪（Flow cytometry）BAL的正常细胞学检查结果健康非吸烟者健康吸烟者细胞总数 x 10 67 + 323 + 12巨噬细胞 % 8096 + 3淋巴细胞 % 15 7嗜中性细胞 % 3 2嗜酸性细胞 % 0.5嗜硷性细胞 % 0.