微机模拟蛋白质纯化实验.doc

微机模拟蛋白质纯化实验学号： 1035130150姓名： 李睿班级： 生命科学学院 10级 生物工程邮箱： 1059508633 一、 实验目的：1. 了解模拟生化干实验的方法和意义，掌握用protein软件提纯蛋白质的方法 。 2. 进一步熟悉层析、热变性、盐析等常用生化分离方法的原理和应用。 二、 实验原理： 1： “Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 2： “Protein”提供的分离纯化方法有七种：热变性；硫铵沉淀；排阻层析(凝胶色谱)；离子交换层析；吸附层析；聚焦层析；制备电泳。 3： 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排阻层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 4： “Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 三、 实验要求：完成实验软件中三种酶的分离纯化。 四、 实验步骤：实验中为了比较在样品性质不同情况下，如何有效分离，以及各种方法的优劣，拟分离如下三种样品： 1. pH稳定范围较大的1号蛋白 2. 碱性条件下稳定的36号蛋白 3. 酸性条件下稳定的3号蛋白 1：酸性条件下稳定的3号蛋白 3号酶在62以下稳定，稳定pH范围3.85.8（酸性条件）。 以上为总步骤 二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数） 以上为第一步骤具体参数以上为第二步骤具体参数 以上为第三步骤集体参数以上为第三步洗脱曲线以上为第三步之后的二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数） 以上为第四步的具体参数以上为第四步的洗脱曲线以上为第四步之后的二维电泳，pH 310，分离胶浓度20（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）已经达到一个点的要求PAGE：分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0已经达到一个点要求SDS-PAGE：分离胶浓度20（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）。已经达到一条线要求由以上试验可得酶活力回收91.86，纯化倍数为20.577，耗费986.8054元，费时35小时。2：碱性条件下稳定的36号蛋白36号酶在31度下稳定，稳定pH范围7.7-10以上为总步骤二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数） 第一步的具体参数第一步的洗脱曲线第一步之后的二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）第二步的具体参数 第二步的洗脱曲线二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）已经达到一个点PAGE 缓冲体系：Gly-NaOH（pH8.6-10.6），pH8.6。可以看出，已经基本达到一个点。SDS-PAGE：分离胶浓度10%（体积分数），浓缩胶浓度3%（体积分数）已经达到只有一条清晰的线由以上试验可得酶活力回收93.01，纯化倍数为15.605，耗费340元，费时20小时。3： pH稳定范围较大的1号蛋白1号酶在50度下稳定，稳定范围2-11(稳定范围较大)以上为总步骤二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数） 以上为第一步的具体参数以上为第二步的具体参数以上为第二步骤的洗脱曲线以上为第二步后二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）以上为第三步的具体参数以上为第三步的洗脱曲线二维电泳，pH 310，分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数）已经达到一个点PAGE：分离胶浓度10（体积分数），浓缩胶浓度3（体积分数），缓冲体系：磷酸二氢钾-NaOH，pH 8.0