植物分析实验.doc

植物分析实验指导书安徽农业大学 资环学院2008年6月植物样品分析实验目录实验一 植物样品采集、制备和保存(一)植物组织样品的采集、制备和保存(二)瓜果样品的采集、制备和保存(三)籽粒样品的采集、制备和保存 实验二 植物样品的水分测定(一)风干植物等含水较少试样的水分测定（常压直接烘干法）(二)幼嫩和新鲜植株等含水较多试样的水分测定（常压二步烘干法）实验三 直接灰化法测定植物样品的粗灰分实验四 植物样品消化(一)H2S04H202法(二)混合加速剂消煮法实验五 植物样品中氮的测定 (一)奈氏比色法 (二)半微量蒸馏法 实验六 植物样品中全磷测定(钒钼黄比色法) 实验七 植物样品中全钾测定(火焰光度法) 实验八 植物钙镁的测定(EDTA络合滴定法) 实验九 土壤和植物中硼的测定 (一)姜黄素比色法 (二)甲亚胺H比色法 (三)植物样品干灰化及硼测定 实验十 土壤和植物锰的测定(KMn04比色法) (一)土壤有效锰测定(二)植物中锰的测定 实验十一 土壤和植物中铜、锌的测定(原子吸收分光光度法) (一)土壤中有效铜、锌测定 (二)植物中铜、锌测定 实验十二 硫氰酸盐比色法测定土壤和植物中的钼实验十三 土壤和植物中铁的测定(邻菲罗啉比色法) (一)土壤有效铁测定 (二)植物中铁的测定实验十四 纯蛋白质的测定 (一)沉淀分离后消化测定(二)染料结合法实验十五 氨基酸总量的测定(茚三酮比色法) 实验十六 水溶性糖的测定(蒽酮法) 实验十七 淀粉的测定(HCl水解一菲啉碘量法) 实验十八 粗脂肪的测定(残余法) 实验十九 果蔬总酸度的测定 实验二十 维生素C的测定 (一)2，6二氯靛酚滴定法 (二)荧光测定法 实验二十一 氮肥的测定 (一)甲醛法(铵态氮肥中氮的测定) (二)蒸馏法(尿素含氮量测定) 实验二十二 磷肥的测定 (一)喹啉钼酸重量法(过磷酸钙有效磷测定)(二)喹啉钼酸容量法 (三)过磷酸钙中游离酸测定 (四)钒钼黄法(磷矿粉中有效磷测定) 实验二十三 钾肥测定 (一)火焰光度法 (二)四苯硼钠重量法 实验一 植物样品采集、制备和保存(一)植物组织样品的采集、制备和保存植物组织样品的采集首先是选定有代表性的株样。如同土壤样品的采集方法，在田间按照一定的路线多点采取组成平均样品。株样数目应视植物的种类、株间变异程度、种植密度、株样大小或生育期以及所要求的准确度而定，一般为10-50株。从大田或实验区采样要注意群体的密度、长势、生育期的一致。如果为了某一特定的目的，例如缺素诊断采样时，则应注意株样的典型性，并且要同时在附近地块选取有对比意义的正常典型株样，使分析结果能通过比较说明问题。用于营养诊断测定样品还要特别注意植株的采集部位的组织器官及采样的时间。采样的植株如需要分不同的器官测定，需要立即将其剪开，以免养分运转。剪碎的样品太多时，可在混匀后用四分法缩分至所需要量。用于营养诊断分析的样品还应尽可能立即称量鲜重。采集的植株样品是否需要洗涤应视样品的清洁程度和分析要求而定。一般微量元素的分析和肉眼明显看得见或明知受到施肥污染的样品需要洗涤。植物样品应在刚采集的新鲜状态冲洗，否则一些易溶性养分很容易从已经死亡的组织中洗出。一般可以用湿棉布（必要时可沾一些很稀的如1mg/L的有机洗涤剂）擦净表面的污染物，然后用蒸馏水或去离子水淋洗1-2次即可。一般测定不容易起变化的组分用干燥样品较方便。新鲜样品应该立即干燥，减少体内呼吸作用和霉菌活动引起的生化变化。植株样品的干燥通常分两部分：先将鲜样在80-90烘箱中鼓风烘15-30min（松软组织15min，致密组织烘30min），然后降温到60-70，逐尽水分。干样品可用研钵或带柄刀片或齿状（用于种子样品）的磨碎机粉碎，并过筛。分析样品的细度应视称量的多少而定，通常可用圆孔直径为0.5-1mm筛，称量少于1g的样品最好过0.25mm甚至0.1mm筛。过筛后应充分混匀，保存于磨口的广口瓶中，内外各贴一样的标签。样品瓶应置于洁净、干燥处。若样品可能需要保存很常时间，应进行灭菌（如射线），然后置于聚乙烯或袋中封口保存。样品在粉碎和储藏过程中，又会吸收空气中的水分。所以，在精密分析称样前，还必须将粉碎的样品在65（12-24h）或90（2h）再次烘干，一般常规分析则不必。称样时应充分混匀后多点采样，这在称样量少而样品相对较粗时更应特别注意。用于微量元素分析的样本采集与制备应特别注意要防止可能引起的污染。例如在干燥箱中烘干时，应该防止金属粉末的污染。用于样品采集和粉碎样品的研钵设备应该采用不锈钢器具和塑料网筛。如要准确分析铁，最好在玛瑙研钵上研磨。(二)瓜果样品的采集、制备和保存瓜果是泛指果实、果浆和块茎、块根等。瓜果的成熟期很长，一般主要在成熟期采样，必要时在此期采2-3次。每次应在实验区或地块中随机采取10株以上位相同、成熟度一致的瓜果组成平均样品。平均样品的果实数，较小的如青椒不少于40个，番茄、洋葱等不少于20个；黄瓜、茄子不少于15个；较大的如西瓜、大白菜等不少于10个。数量多时，则可以切取果实的1/4组成平均样品，总重以1Kg左右为宜。 果树的果实采样特别要注意选择品种特征典型的样株才能比较各品种的品质。样株要注意挑选树龄、株型、生长势、载果量一致的正常株，老、幼和旺盛生长的果实都缺乏代表性。在同一果园同一样品的果树中选3-10株作为代表株，从每株的全部收获物中选取大小的向阳和背阴的果实共10-15个组成平均样品。一般总重不少于1.5Kg。 采回的瓜果样品应该冲洗、擦干。瓜果蔬菜的分析一般都要新鲜的样品。随分析的目的要求不同，有的要全部样品，有的只要可食部分。大的样品或数量多时，可均匀地切其中一部分，但所取部分中各种组织的比例应与全部的相当。样品经切碎后用高速组织粉碎机或研钵打碎成浆状。从混匀的浆液中取样。多汁的瓜果也可在切碎后用纱布或直接用手挤出大部分汁液，将残渣粉碎后在与汁液一起混匀、称样。 新鲜瓜果的短时间内保存可以采用冷藏或酒精浸泡处理，将已经称量的新鲜样品加入足够量的沸热中性950ml/L乙醇，使其最后浓度达800ml/L，再在水浴回馏0.5h。如欲制成干样则立即干燥，尽量使样品成分不发生变化。可以采用类似幼嫩或新鲜植株等含水较多试样的水分测定，即先短时间110-120高温，然后降到60-70的二步烘干法的类似步骤快速干燥样品，但总的烘干时间不宜长，一般为5-10h。最好用真空烘箱。(三)籽粒样品的采集、制备和保存籽粒样品一般也多用于品质分析。从个别植株上如谷类或豆类作物上采取种子样品时，应考虑栽培条件的一致性。种子脱粒后，去杂、混匀，按四分法缩分为平均样品，重量不少于25g。若从实验小区或大田采集可按植株组织样品的采集方法，选定株样后脱粒、混匀，四分法后取得约250 g样品。大粒种子如花生、大豆、蓖麻等可取500g左右。采样时应选择完全成熟的种子，因为不成熟的其化学成分有明显的差异。若从成批收获物中取样，则应在保证样品有代表性的原则下，在散装堆中设点随机取样，或从包装袋中随机取原样品，再用四分法或分样器缩分至500g左右。将采取的籽粒样品风干，去杂的挑去不完整粒，用磨样机或研钵磨碎，使其全部通过0.5-1mm筛，处于瓶或袋中，内外贴上和放置标签备用。油料作物中的大粒种子，如花生、向日葵、等，应去掉厚的果壳或种皮，只分析种仁。但棉籽种皮不容易剥掉，可用水浸泡4-6h，在用刀将种子切成两半，取出种仁。为了防止油料作物种子在磨碎过程中损失油分，可以从采取的样品中用四分法缩分出少量样品，在70-80干燥箱内干燥15-18h，取出，在瓷研钵中用研棒击碎，不能研磨。大豆和其他含油相对较少的种子则可以直接用植物搅拌机。实验二 植物样品的水分测定(一)风干植物等含水较少试样的水分测定（常压直接烘干法）一、方法原理样品在100-105情况下烘干一定时间至“恒重”，即失去的重量，被认为是水分重量，所以这是一种间接的测定水分方法。样品在高温烘烤时可能有部分易焦化、分解或挥发成分损失而产生水分测定的正误差，也可能因为水分未完全逐尽（特别是胶体和半胶体的试样，其结合水难以完全排除）或在样品冷却、称量时吸湿，或有部分油脂等被氧化增重而造成的负误差。但在严格控制操作条件下，对大多数试样而言，烘干法仍然是测定水分的简易标准法。二、实验仪器（1）电热烘干箱（2）称量铝盒（3）干燥器。宜使用经135干燥2-3h的变色硅胶作干燥剂，对油脂类样品宜用吸湿力强的五氧化二磷等作干燥剂。（4）分析天平三、操作步骤1. 取洁净的铝盒，打开盒盖，放入100-105烘箱中烘30min，取出，移至干燥器中平衡后称重，继续烘干至“恒重”。2. 将粉碎、混匀的风干样品3-5.000g平铺在铝盒中盖好盖，尽快地称量铝盒和内容物质量。3. 将盖横放在盒旁，置于已经预热至115的烘箱中，调整温度至100-105，烘干3-4h，取出盖好，移入干燥器冷却后称量，如此反复，直至“恒重”。四、结果计算水分（%）风干基=（m1-m2）x 100/（m1-m0）干物重（%）风干基=（m2-m0）x 100/（m1-m0）式中： m0空铝盒的质量（g） m1（空铝盒+样品）的质量 m2（空铝盒+烘干样品）的质量五、注意事项1. 本法适用于风干植物、谷物种子类及其加工品、干茶叶、咖啡、坚果、肉、海带等绝大部分含水较少的试样。2. 应注意样品的采集、储藏和粉碎时水分的变化。一般情况下，粮食样品颗粒过分干燥不好，粉碎时可造成样品的水分变化。3. 粮油种子类样品经粉碎后也可以采用130烘干20-60min的快速烘干法，其结果与常规法相近。4. 烘干法测水分时尤以大气湿度影响最大，因此实验室内相对湿度不应高于70。称重烘干样品的速度要快。5. 在植物样品或农产品分析中，为易于理解和接受，水分的计算习惯都以分析样品（风干后新鲜样品）为基础。如某一含水%（鲜湿基）为85%的新鲜植物样品，如以干样计算，它的含水将为556%，前者易于理解，后者则难理解。(二)幼嫩和新鲜植株等含水较多试样的水分测定（常压二步烘干法）一、方法原理对于新鲜的植株或高水分种子及新鲜果实、蔬菜、其他液态、糊状及加热易溶解、油水分离的样品，如直接在100烘烤其外部组织可能形成干壳，反而障碍内部水分向外扩散逸出，而且干燥后的样品常在称量容器底部形成脱落的焦状干壳，加上样品含水多，要求蒸发时面积大。因此可以采用二步烘干法，即将新鲜样置于口径较大的称量容器中，添加硅砂或硅藻土作为干燥辅助剂，先在低温（50-55）鼓风3-4h至烘脆，或在沸水浴上加热20-40min以除去大部分水，大致干燥后再在100-105烘干至“恒重”。二、实验仪器（1）水浴锅（2）称量容器（3）硅砂。40-60目，新售的应先用1：1的盐酸加热煮沸清洗，再用水洗成中性后经135干燥，装于瓶中密封保存。（4）其余同常压直接干燥法三、操作步骤1. 取一洁净称样瓶，加15-25g干净硅砂，插入一根短玻棒，放入100-105烘箱中烘30分钟，取出，移至干燥器中平衡后称重，继续烘干至恒重。2. 向瓶中加入剪碎、混匀的多汁新鲜样约5g，用玻璃棒将样品与硅砂充分混匀后再称量。将瓶和内容物先放在50-55的烘箱中鼓风烘3-4h，每隔0.5h搅拌一次，样品烘烤后用玻璃棒轻轻压碎（或者将瓶和内容物先放在沸水浴上加热20-40min，每隔3-5min搅拌一次，使物料大致干燥或变成稠厚）。3. 最后置于温度为100烘箱中鼓风烘1-2h至恒重。四、结果计算水分%（鲜湿基）=（m1-m2）x 100/（m1-m0）干物质%（鲜湿基）=（m2-m0）x 100/（m1-m0）式中： m0（称样瓶+短玻棒+硅砂）的质量（g）m1（称样瓶+短玻棒+硅砂+鲜样）的质量m2（称样瓶+短玻棒+硅砂+烘干样）的质量五、注意事项1. 铝制称样瓶放在铜水浴锅预干燥，可使其腐蚀，所以最好是放在玻璃称量瓶中加热预干燥。2. 样品预干燥最好采用减压加热干燥法，压力50X133.3224Pa，温度60-70。3. 烘干的硅砂和样品易吸湿，称量要快速。实验三 直接灰化法测定植物样品的粗灰分一、方法原理总灰分常用简单、快速、节约的干灰化法测定。即将样品小心加热炭化和灼烧，除尽有机质，剩下的无机矿物冷却后称量，即可计算样品总灰分含量。由于燃烧时生成的碳粒不容易完全烧尽，样品上可能粘附有少量的尘土或加工时混入的泥沙等，而且样品灼烧后无机盐组成有所改变，如：碳酸盐增加，氯化物和硝酸盐的挥发损失，有机磷、硫转变为磷酸盐和硫酸盐，质量均有改变。所以实际测定的总灰分只能是“粗灰分”。二、实验仪器（1）灰化器皿：15-25ml的瓷或白金、石英坩埚（2）高温电炉：在525-600能自动控制恒温（3）干燥器：内置干燥剂为135下烘干几小时的变色硅胶（4）分析天平（5）水浴锅或高温鼓风烘箱三、实验试剂1. 硝酸（1：1）溶液2. 双氧水（H2O2）=30%3. 100g/LNH4NO3溶液四、操作步骤1. 样品预处理可以采用测定水分或脂肪后的残留物作为样品：需要预干燥的试样。含水较多的果汁，可以先在水浴上蒸干；含水较多的果蔬，可以先用烘箱干燥（先在60-70吹干，然后在105下烘），测得它们的水分损失量，富含脂肪的样品，可以先提取脂肪，然后分析其残留物。谷物、豆类等干燥试样一般先粉碎均匀，磨细过1mm筛即可，不宜太细，以免燃烧时飞失。2. 灰分测定：将洗净的坩埚置于550高温电炉内灼烧15min以上，取出，置于干燥器平衡后称重，必要时再次灼烧，冷却后称重量直至恒重为止。准确称取待测样品2-5g（水分多的样品可以称取10g左右），疏松地装于坩埚中。3. 碳化：将装有样品的坩埚置于可调电炉上，在通风橱里缓缓加热，烧至无烟，对于特别容易膨胀的试样（如蛋白质、含糖和淀粉多的试样），可以添加几滴纯椰榄油再同上预碳化。4. 高温灰化：将坩埚移到已烧至暗红色的高温电电炉门口，片刻后在放进高温电炉内膛深处，关闭炉门，加热至约525（坩埚呈暗红色），或其他规定的温度，烧至灰分近于白色为止，大约1-2h，如果灰化不彻底（黑色碳粒较多），可以取出放冷，滴加几滴蒸馏水或稀硝酸或双氧水或100g/LNH4NO3溶液等，使包裹的盐膜溶解，碳粒暴露，在水浴上蒸干，再移入高温电炉中，同上继续灰化。灰化完全后，待炉温降至约200时，再移入干燥器中，冷却至室温后称重，必要时再次灼烧，直至恒重。五、结果计算粗灰分（%）=（m2-m1）/（m3-m1）x 100式中：m1空坩埚重（g） m2灰化后（坩埚+灰分）质量（g） m3（空坩埚+样品）质量（g）六、注意事项1. 该方法一般适用于大多数植物茎、叶、根、蔬菜、水果、饲料、茶叶、咖啡、坚果及其制品，牛乳、提取脂肪后的油脂类、糖及糖制品，鱼类及其制品，海带等试样。2. 灰化容器一般使用瓷坩埚。如果测定灰分后还测其它成分，可以根据测定目的使用白金、石英等坩埚。也可以用一般家用铝箔杯来代替，因其质地轻，能在525-600的一般灰化温度范围内稳定地使用，特别是用于灰分量少、试样采取量多、需要使用大的灰化容器的样品，如淀粉、砂糖、果蔬及其它们的制成品，效果会更好。3. 各种试样因灰分量与样品性质相差较大，其灰分测定时称样量与灰化温度不完全一样。4. 新的瓷坩埚及盖可以用FeCl3和黑墨水的混合液编写号码，灼烧后即遗有不易脱落的红色Fe2O3痕迹的号码。5. 由于灰化条件是将试样放入达到规定温度的电炉内，如不经碳化而直接将试样加入，因急剧灼烧，一部分残灰将飞散。特别是谷类、豆类、干燥食品等灰化时易膨胀飞散的试样，以及灰化时因膨胀可能逸出容器的食品，如蜂蜜、砂糖及含有大量淀粉、鱼类、贝类的样品一定要进行预灰化。6. 对于一般样品并不规定灰化时间，要求灼烧至灰分呈全白色或浅灰色并达到恒重为止。也有例外，如对谷类饲料和茎秆饲料灰分的测定，则有规定为600灼烧2h。7. 即使完全灼烧的残灰有时也不一定全部呈白色，内部仍然残留有炭块，所以应充分注意观察残灰。8. 有时灰分量按占干物质的质量分数表示，如谷类、豆类及其制品的国际标准（ISO）及谷类产品的国际谷化协会（ICC）标准灰分测定均按此表示。实验四 植物样品消化 (一)(H2S04H202法)一、方法原理先用浓H2S04消煮植物样品，然后加入H2O2加速氧化过程，使有机态氮转化为NH4+N，各种形态的磷、钾也释放出来，制得的待测液,可供N、P、K等元素的测定。二、实验试剂1浓H2S042H202(30) 三、实验仪器电炉、开氏瓶四、操作步骤1用1万天平称取植物干样0.30.4g，小心倒入开氏瓶底部，勿使沾在颈部。2. 加入浓H2S04 5ml轻摇开氏瓶，使植物样全部为H2S04浸润(可放置过夜)。3. 在电炉上加热，至冒白烟(通风橱中加热，约1520min)。4取下开氏瓶置于开氏瓶架上，稍冷却，然后边摇边滴加H202 10滴。5置于电炉上加热，至冒白烟(25min)。6再取下开氏瓶，稍冷却，加H202 68滴，摇动，置电炉上加热，如此进行几次，每次随消化溶液颜色变浅而渐渐少加H202，直至消化液五色透明后，再微沸5min，去尽CO2。7取下开氏瓶，冷却，小心加入1020ml蒸馏水，冷却，转移人100ml容量瓶中。8用少量水洗开氏瓶34次，洗液均移入容量瓶中，冷却后，用水定容，澄清或过滤后供N、P、K测定用。同时做空白，除不加植物样外，同样进行。五、注意事项1植物干样应磨细烘干。植物干样容易吸湿，称量时难以稳定，称量操作要快，最好用称量瓶称或用称量纸包起来称。如用鲜样分析，样品应剪碎，称取35g，称样也要迅速。2开氏瓶颈必须干燥无水，以免样品沾在瓶颈部。样品倒入瓶内时，可将称量纸卷成筒状，伸入瓶内加样。如有样品沾在瓶颈上端，必须用少量水或H2S04将其冲下，否则会造成损失。3加人浓H2S04的量，应视样品量多少而异，一般1g样加10ml浓H2S04。4为了使样品能与H2S04充分混匀，先将样品在瓶底散开，再加H2S04轻轻摇动，注意不要将样品摇动到颈部。如样品不散开，加H2SO4后容易结块，内部不被H2S04浸润，会加长消煮时间。也可以先加水浸湿样品，再加H2SO4，但不可多加水，否则由于稀释H2S04使消煮时间大大延长。 5开始加热时应小心控制温度，以免产生过多泡沫，尤其是含蛋白质多的样品。如有大量泡沫上溢，应停止，否则泡沫冲出会导致实验失败，甚至损坏电炉等。为减少泡沫生成，可加入少量消泡剂如异辛醇等；也可加H2S04后放置过夜，然后消煮。6. 加H202时间不要过早，应该用H2S04消煮20min以上，再加H202。H2O2反应后生成H20，冲稀H2S04使其氧化作用减弱，消煮温度降低，有时反而会延长消煮时间。7加H202应直接滴加在溶液中，应待开氏瓶稍冷却后加，以免局部反应过剧烈，造成氮损失，如果有样品或浓H2S04沾在瓶颈部，可用H202滴冲下去。8加H202的量应逐步减少，每次加入后加热微沸即可，使氧化和还原作用平衡进行。加入H202的次数和量应视消煮液的颜色决定，消化液颜色由棕黑色呻棕红色啼棕黄色一无色，色深时可多加，色浅时应少加。消煮至五色时，再加热5min，去除多余的H202，否则会影响N、P的比色测定。9. 消煮过程中，经常摇动开氏瓶，使沾在瓶壁上的样品和H2S04流入瓶底反应。10. 消化完毕后，待冷却后再加水稀释，防止热H2S04遇水过激作用，水应沿瓶壁慢慢加入，边加边摇，冷却后再转入容量瓶，为加速开氏瓶冷却，可用冷水在瓶外冷却。11. 方法不包括N03-N转化，如果包括N03-N在内，应先用锌粉或Na2S203还原N03-N。六、思考题1消煮过程中，H2S04，H202的作用是什么?2用H2S04H202消煮，应注意些什么?理由是什么?如果样品只测P和K，是否可以多加，快加H202以加快消化速度? 3开氏瓶颈如沾有少量样品，对测定会有什么影响?如何纠正?4称样时间过长，加H202后煮沸温度过高，加H202时开氏瓶未冷却，所用H202纯度低，这些因素对样品中N、P、K的测定有什么影响?(二)混合加速剂消煮法一、方法原理植物样品在催化剂的参与下，用浓硫酸消煮分解，使其中的氮转化为NH4+，制得待测溶液，可用于测定氮含量。二、实验试剂1浓H2SO4 2混合加速剂：K2S04：CuS04：Se=100：10：l按此比例取试剂混合研磨，过80目筛，混匀。消煮时每毫升H2S04加0.37g混合加速剂。三、实验仪器开氏瓶、电炉、天平(1万)四、操作步骤 1准确称取干植物样品0.2 0.3g，小心倒入开氏瓶内，注意勿使沽在瓶颈上。2加入混合加速剂约1.8g，滴加几滴水使样品湿润。3加入浓硫酸5ml，摇匀，置于电炉上，小心加热。4消煮至溶液清亮带浅兰色时，再加热约10min，取下冷却。5加少量水稀释，冷却后转移入50ml容量瓶中，用水分几次洗净开氏瓶，洗液均移入容量瓶内，用水定容，供测氮用。同时做空白。五、注意事项1样品称取及加H2S04等操作注意事项同前(H2S04一H202法)。2消煮过程中应经常转动开氏瓶、使溅在瓶壁上的样品回到酸液中反应，消煮好时瓶内壁不应该有黑或棕色污点。3开始时控制炉温，防止泡沫冲出。4用此法消煮所得待测液，应该用蒸馏法或电极法测NH4+N，不可用比色法测定N，待测液也不可用于测磷和钾。5. 该法不包括NO3-N。实验五 植物样品中氮的测定(一)奈氏比色法一、方法原理铵离子在碱性条件下与奈氏试剂反应生成黄色络合物Hg20(NH4)I，在铵离子浓度不高的一定范围内，颜色深浅与铵浓度成正比，可以比色测定，反应式： 2KI+HgI2K2HgI4NH4+ + K2HgI4 + 3KOHHg2O（NH4）I+7KI+H2O该法适用于微量NH4+测定，测定范围为0.2 3ppm。二、实验试剂1奈氏试剂：100g HgI2和70g KI溶于300ml水中；60g NaOH溶于500ml水中，冷却后将慢慢加入中，边加边搅拌，然后用水稀释为1000ml，静置过夜，取清液贮于棕色瓶中。2. 10酒石酸钠：10g酒石酸钠(Na2C4H4042H20)溶于水中，稀释到100ml。31阿拉伯胶：1g阿拉伯树胶溶于100ml沸水中，加热溶解，加2滴氯仿防腐(如混浊,待澄清后取上部清液用)。48KOH溶液：8g KOH溶于水中，加水至100ml。5氮标准溶液：称取100烘干过的NH4Cl 0.3817g，溶解定容为1000ml，此为100ppmN(NH4+N)标准液。吸取上述溶液10ml，稀释定容为100ml，即为10ppmN(NH4+N)标准液。三、实验仪器721分光光度计。四、操作步骤1吸取植物样品消煮定容后的澄清溶液1 2m50ml容量瓶中，加水约30ml。2加10酒石酸钠2ml，摇匀，加8 KOH(1 2ml)中和。3加10滴阿拉伯胶溶液，摇匀。4边摇边加入2ml奈氏试剂，摇匀，用水定容。5放5分钟后比色测定，以空白溶液为零点，波长425或490nm，读取吸光度值。从标准曲线上查出比色溶液N(NH4+N)浓度。标准曲线： 分别吸取10ppmN标准溶液0、2、4、6、8、10ml，置于50ml容量瓶中，同上进行显色测定(不加KOH中和)；所得标准系列溶液含NH4+N依次为0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.Oppm。以NH4+N浓度为横轴，吸光度为纵轴作标准曲线。五、结果计算样品N = (ppm x 50 x 100 x 10-4) /(W x V)式中：ppm测定液的NH4+N浓度W样品重(g)V吸取消煮液体积(m1) 六、注意事项1. 奈氏试剂有不同配法，不同配法的灵敏性稍有差异，不论何种配法，开始都会有沉淀生成，要澄清后取清液用，应避光保存。有的配法用过滤法，应注意奈氏试剂溶解普通滤纸，过滤时往往要很快更换滤纸，相比而言，澄清法比较省事。2奈氏试剂的其它配法：5g KI溶于5ml水，3.5g HgCl2溶于20ml水中(加热溶解)，将HgCl2溶液慢慢加入KI溶液中，不断搅拌，直到出现少量微红色沉淀，然后加30 KOH溶液70ml，搅拌，再加几滴HgCl2溶液，至出现红色沉淀后，混匀静置过夜，取清液贮于棕色瓶中。 其它配方：奈氏试剂KI HgCl2 HgI2 NaOH KOH 溶液 碱浓度(g) (g) (g) (g) (g) (m1) (N)1 35 45.0 112 1000 20 2 35 20 105 1000 263 50 足量 140 1000 35上述奈氏试剂在室温下均可用，不同温度时使用效果有差别，碱度大的显色快，但易浑浊；碱度小的不易浑浊，显色慢。温度低时(13 15)可用奈氏试剂，显色快，读取时间30min 2h；温度高时可用工，测读时间为显色后1060min；全年用一种时，可用，20以上时10 60min测定，15OC以下时30min 2h内测定。3. 铵浓度不同时，与奈氏试剂反应生成物从淡黄色到红棕色，NH4+多时生成红褐色沉淀,所以溶液NH4+浓度高时，必须先稀释到一定范围后才能用此法测。方法适用于低含量N的测定。如样品含N量高，为避免过大的稀释误差，应改用蒸馏法、电极法等方法测定。4随显色溶液温度增加，铵浓度增加，奈氏试剂碱度增加而易产生浑浊，为防止混浊，应该控制温度、降低NH4+浓度，同时加酒石酸钠和阿拉伯胶防止浑浊。溶液中的Ca2+、Mg2+、Fe3+在强碱性时会生成沉淀而使溶液浑浊，加酒石酸钠可络合掩蔽去除它们的干扰，酒石酸钠必须先加，否则不能起掩蔽作用。如加入奈氏试剂后发现溶液有白色沉淀浑浊，说明仍有Ca24、Mg2+干扰，遇此情况可以多加12倍酒石酸钠溶液，所用酒石酸钠应该无铵(用前在900C烘几小时)。也有人用5EDTA代替酒石酸钠，但效果不如酒石酸钠，同时由于EDTA消耗奈氏试剂，需多加奈氏试剂才行。阿拉伯胶对溶液起保护作用，可提高胶体溶液的稳定性，防浑浊。但用量多少对黄色深浅有一定影响，多加色浅，少加色深，所以加入量必须准确一致。5加奈氏试剂前，溶液应调到近中性，因为在强酸性溶液中加奈氏试剂，会出现红色沉淀(HgI2)或别的颜色干扰。用8 KOH中和时，最好另取相当量待测液做空白试验，用酚酞作指示剂，用KOH滴加至刚显红色，即为应加KOH的量。络合反应是在强碱性条件下进行，如pH= 11。但如显色时碱度过高，也会产生沉淀，应控制在0.3MOl/L以下。6由于络合物的稳定时间不长，显色后应在1h以内比色完，同一批测定样品数不要过多。7. 比色测定的波长可用410nm、425nm、440nm、490nm，反应生成物的吸收与奈氏试剂的吸收值之差在422 425nm处最大。如含量低时，用425nm波长测定；NH4+含量高时，用490nm测定。8. 必须注意所用水、试剂中无NH4+，注意实验室无NH3污染干扰。七、思考题1奈氏试剂的配制和保存应注意些什么?试剂中各成份的主要作用是什么?不同配制方法所得奈氏试剂的使用条件和效果有无不同?2如果在操作过程中将奈氏试剂、阿拉伯胶水、酒石酸钠的加入顺序颠倒了，有什么影响?为什么?3按操作步骤认真进行，加奈氏试剂后发现溶液中有白色浑浊生成，可能原因是什么?如何解决?如发现有红褐色沉淀生成，原因是什么?如何解决? 4是否每次测定都必须同时作标准曲线?5为什么有时用490nm波长比色，有时又用440nm波长比色?6. 奈氏比色法测NH4+N，对溶液的酸碱度有什么要求?如何调节和控制碱度条件? (二)半微量蒸馏法一、方法原理样品溶液在半微量定N蒸馏器中，加碱蒸馏，将氨吸收在硼酸液中，用标准酸滴定，由酸消耗量计算溶液含N量。反应式为：(NH4)2S04 + 2NaOH Na2S04 + 2NH3 + 2H20NH3 + H3B03 NH4H2B032NH4H2B03 + H2SO4 (NH4)2S04 + 2H3B03 二、实验试剂1NaOH(40)：40gNaOH溶于水，加水到100ml，放置澄清后取清液用。 2定N混合指示剂：称0.1g 甲基红，0.5g溴甲酚绿指示剂，研磨，溶解于lOOml 95乙醇中，用稀酸或碱调pH4.5。3. 2硼酸浓度：取20g分析纯硼酸，用热水(60)溶解，冷却后，加入5ml定N混合指示剂，如水到1000ml，用稀HCl或稀NaOH调节pH为4.5。4. 1/2H2S04标准溶液(0.02mol/L)：取浓H2S04 2.8ml，加入水中，稀释至5000ml，用硼砂或标准碱标定。三、实验仪器半微量定N蒸馏器，半微量滴定管。四、操作步骤1吸取待测液10ml，放入半微量定N蒸馏器内室。 2取10ml 2H3B03吸收液于三角瓶中，置于蒸馏器冷凝管下口。3在蒸馏器中加入5ml 40NaOH，立即塞紧。4通入蒸汽蒸馏5 10min(收集馏出液约30m1)。5用很少量水冲洗冷凝管下口，取出三角瓶。6用0.02mol/L标准1/2H2S04滴定，至突变为红紫色为终点，读取所用酸ml数。五、结果计算样品含N = (C x V x 14 x 10-3 x 100 x 100)/(W x 10)式中：C标准酸浓度V滴定用标准酸m1数14N的摩尔质量W样品重(g) 六、注意事项1. 定N混合指示剂也可以不在配制硼酸吸收液时加入，而在蒸馏之前加入H3B03吸收液中，加1滴即可。加了混合指示剂的吸收液颜色为淡红色，不得为淡蓝色，用眼睛判断往往不准，所以应该用酸度计来调pH为4.5。2也可以用3H3B03溶液。硼酸应该用分析纯以上的，硼酸纯度越高，浓度越小，则滴定终点越鲜明。3在蒸馏样品待测液前，先通蒸气空蒸5min，以除去蒸馏系统中可能存在的N污染。4半微量蒸馏，冷凝管口不必插入吸收液中，可防止倒吸和减少洗涤手续。5蒸馏过程中内室可能有泡沫产生，如冲上馏出管则会造成误差或失败，故每次蒸馏加样品溶液量不要多，5 10ml即可，通人蒸气的速度要控制，不使沸腾过激烈。6所用的40NaOH溶液，配制后应放置一天后用，使其中可能有的Na2C03等沉淀下去，否则加入样品溶液中与酸反应会产生许多CO2气体。7蒸馏结束后，及时用反吸法将半微量蒸馏器内室洗净。七、思考题1硼酸吸收液吸收NH3H20后，颜色应由紫红变为绿色，但在蒸馏已经进行了5min后,吸收液仍未变色，这可能有哪些原因引起?如何解决?2. 如果加入蒸馏器中的样品溶液量过多或过少，对测定有何影响?如NaOH加入量过多或过少呢? 3. 如果冷凝管口插入H3B03吸收液中，不小心发生了倒吸现象，可能原因有哪些?如何解决? 4在用标准酸滴定硼酸吸收液时，不小心滴过了，如果不重新取样蒸馏，你有没有办法得出滴定到终点标准酸的准确用量?5.2硼酸吸收液每ml能吸收0.92mg N，如在三角瓶中加入过少或过多的硼酸吸收液，对测定结果会有什么影响?对1.5含N量的样品，用多少硼酸吸收液较合适?实验六 植物样品中全磷的测定(钒钼黄比色法)一、方法原理在一定的酸度条件下，磷酸、偏钒酸、钼酸结合为多元络合物，其组成可能为P2O5、V205、22M00、nH20，此络合物为黄色，在一定范围内，溶液颜色深浅与含磷量成正比，可进行磷的比色测定。该法测定溶液中磷的范围为l20ppm，适用于测含磷较高的样品。比色波长可选用400490nm。 二、实验试剂1钒钼酸溶液：A溶液：25g钼酸铵(NH4)6M070244H20溶解于300ml水中；B溶液：1.25g偏钒酸铵(NH4VO3)溶于200ml沸水，冷却后加250ml浓HNO3，冷至室温。将A液慢慢加入B液，搅拌，用水稀释至1000ml。2. 6MOL.L-1 NaOH：240gNaOH溶于1000ml水中。3. 2MOL.L-1 HCI：20ml浓HCl加人100rd水中。4. 2，6一二硝基酚：05g2，6二硝基酚溶于200ml水中变色范围是pH24(无色)一40(黄色)。5. 磷标准溶液(50ppm)：取分析纯KH2P040.2195g(KH2P04经1050C烘干过)，用水溶解，移人1000ml容量瓶，加入l：1 H2S0410ml，用水定容。三、实验仪器721分光光度计 四、操作步骤1吸取澄清的样品待测液10ml一25ml容量瓶中。2加2，6一二硝基酚2滴，用6MOL.L-1 NaOH中和至微黄色，如黄色过深，用2mol/LHCI回滴至微黄色。 3加钒钼酸溶液5ml，用水定容。4放置15min后，比色测定，以空白溶液为零点，波长450nm。读取吸光度，由标准曲线上查得溶液磷ppm数。同时作标准曲线：分别取50ppm磷标准溶液0、1、2、3、4、5ml，从操作步骤2开始同样显色测定，该标准系列溶液含磷分别为0、2、4、6、8、lOppm,以磷浓度对吸光度作标准曲线。 五、结果计算样品含p =ppm 25 (100/10) 10-4/ W式中：ppm一由标准曲线查得测定溶液磷浓度W 样品重(g)六、注意事项1，配制钒钼酸溶液时，应待B液冷至室温再将A液与B液混合，否则配得的溶液颜色不是淡黄色而带有黄绿色。钒钼酸溶液应贮于棕色瓶中，如保存过程中有沉淀生成，不能再用。2如样品含磷量高，应减少待测液取用量，例如取15ml，也可用较高浓度的标准溶液作标准线，线性范围可达20ppm。3选用的比色波长与磷含量有关，波长不同灵敏度不一样，应根据样品含量高低选用合适的比色波长；溶液含磷量(ppm)0.55.5215417220测定波长(nm) 400 440 470 490同次测定中，标准曲线与样品溶液必须用同一波长。4该法允许酸度范围较宽，0.21.6mol/L，常用酸度范围是0.51.O mol/L，最适酸度为0.85 mol/L 。钒钼酸的酸度高(4 mol/L)，所以待测液的酸度不能过大，应先调至0.2 mol/L标准溶液也要同样调酸，标准溶液也要同样调酸度(用2，6一二硝基酚作指示剂)。如酸度过高，灵敏度降低，1.6 mol/L 时，显色不全或不显色，酸度低时灵敏度高，但过低则会产生沉淀及其它干扰。硅酸在溶液中也有类似反应，通过控制酸度在0.50.8 mol/L及控制钒酸盐的量，可防止干扰。5显色时间与温度有关，温度高，显色快，10oC时显色要1520min，30oC时只要2min，室温时，颜色变化小，温差大时颜色深浅有异，所以冬夏不能使用同一标准曲线。 6显色后颜色可稳定24h，显色后5h内颜色保持不变，在20h后光密度约提高2%左右。七.思考题1. 测磷可用钼黄法和钼兰法，比较两法在测定范围，条件反应（酸度，稳定时间，温度，干扰）方面的异同点。2如何选择适当的测定波长？3. 待测液为什么要用NaOH调至中性？如果没有2，6-二硝基酚做指示剂,可用什么?如何调法?4. 某一样品含p8-10%,用钼黄法测磷,试计算称样量,定容体积,显色定容体积,选用适宜的波长测定。实验七 植物样品中全钾的测定(火焰光度法)一、方法原理样品溶液经雾化燃烧,钾原子受高温激发发射出特征光谱,经滤光和光电转换,由检流机检测,在一定范围内测得电流强度与钾含量成正比例,据此测得溶液中的钾。二、实验试剂钾的标准溶液:取1.9068克分析纯kcl(经1050c烘干),溶于水,定容为1000ml,此为1000ppmK标准液。分别取此液0,1,2,3,4,5ml置于100ml容量瓶,各加5ml空白消煮液,用水定容,所得标准溶液含钾分别为0,10,20,30,40,50ppm。三、实验仪器火焰光度计四、操作步骤1. 取植物样品消化液5ml到50ml容量瓶中,用水定容。2. 开启火焰光度计,调节到正常工作状态,测定标准溶液。3. 测定样品稀释液,读取溶液含Kppm数。五、结果计算样品钾%=(ppm x 100 x 50 x 10-4)/(w x 5)ppm测得溶液含Kppm数W植物样重(g)六、注意事项1. 如植物样品只测钾:可不用消化样品,而用较简单的浸提法:取粉碎的植物样品0.5-1.0g,加0.5mol/LHCL(2mol/LNH4OAc-0.2mol/LMg(OAc)2100ml) ,震荡1h,过滤取液,用火焰光度法测定.如含钾高,稀释后测定。2. 标准溶液配置要和待测液的离子组成及酸度尽可能相近,但这比较难做到,通常为减少基体效应和一些离子的干扰：应该将样品溶液稀释后测定，有时也可加干扰缓冲剂NaCl、CaCl2等以减少离子干扰。3. 溶液中钾含量超过100ppm，会由于自吸收等作用而使曲线弯曲，应控制在100ppm以下，最好是在520ppm范围内，这时线性关系最好。4. 溶液中酸度会降低发射光谱强度，待测液酸度不应超过0.25 mol/L，(此实验中约为0.15 mol/L)，样品待测液和标准溶液的酸度相近。5. 温度会影响水的粘度从而影响测定值，一般随温度上升而测定值增加，如某一溶液在100C时测得35.8ppm，20时为40.0ppm，300C时为42.9ppm，所以必须注意同次测定中标准溶液和样品溶液的温度一致，温差2。6要注意保持测定条件稳定性，避免空气流动影响。空气、燃气压力要稳定，管道要清洁。测定过程中，经常用标准溶液校准。 7. 气温低或汽油用的时间较长后，火焰不易点着，可采取如下一些措施：换汽油(80#以上)；调节燃气和空气流量，适当降低雾化器空气压力而增加燃气压力；采取保温措施，使汽油汽化温度提高到3040(可用水浴等，不得用电炉)；在试样和标准溶液中加等量乙醇助燃，方法是：在25ml容量瓶中，加95乙醇7ml，(定容后乙醇浓度为2530)加待测液510ml，水定容。标准溶液也加同量乙醇，定容后测定。用此法可使火焰易点着，稳定性好，而且可提高灵敏度23倍。七、思考题1. 用火焰光度法测钾，常常用浓度直读法，在什么条件下可以浓度直读?在什么情况下不能用浓度直读而可以作标准曲线测定?2. 不同的植物样品，分别用干灰化法、酸消化法，酸浸提法处理，用火焰光度法测定，如果使用同一种标准溶液，对它们的测定会有什么影响吗?如何减少避免这种影响?3火焰点不燃可能有些什么原因?如何解决?4植物中的钾可以用哪些方法提取，根据是什么?5直接用样品消煮液(定容为100ml的溶液，不经过稀释)在火焰光度计上测钾是否好?为什么? 实验八 植物钙镁的测定（EDTA络合滴定法）一、方法原理用干灰化法处理植物样品，用稀HCl溶液溶解灰分制得待测液。用待测液在pH10条件下，用EDTA溶液滴定，测定Ca2+、Mg2+总量；在pH12时，用EDTA滴定，测Ca2+含量，用酸性铬兰K萘酚绿B作指示剂（KB指示剂）。反应示意如下：测Ca2+、Mg2+总量时，与指示剂反应：Mg2+(Ca2+)+In-MgIn(CaIn) (红色)用EDTA滴定：Mg2+(Ca2+) + y Mgy(Cay)(无色)MgIn(CaIn)十y Mgy(Cay) + In（红色 ） (兰色)测Ca2+时，加入指示剂： Ca2+In CaIn (红色)用EDTA络合滴定：Ca2+ + y =Cay(无色)CaIn + y = Cay +In 红色 (兰色)式中In表示指示剂(兰色)，y表示EDTA。加指示剂时生成红色Mg(Ca)In络合物，用EDTA滴定至兰色时为终点。在pHl2时，Mg2+已生成Mg(OH)2沉淀，故此时滴定的仅为钙的含量。二、实验试剂1. 1.2mol/LHCl：100ml浓HCl加入900ml水中 21：1三乙醇胺：100ml三乙醇胺与100ml水混匀。34mol/L NaOH：16gNaOH溶于100ml水中。、4pHl0氨缓冲溶液：取NH4Cl 3375g溶