【毕业学位论文】（Word原稿）大豆疫霉菌的分子检测植物病理学硕士论文

密级 论文编号 国农业科学院 硕士学位论文 大豆疫霉菌的分子检测 I 摘 要 由大豆疫霉菌 （ 引起的大豆疫霉根腐 病 （ 是大豆毁灭性病害之一，是我国的重要对外检疫对象。本实验利用 子标记技术研究大豆疫霉菌的分子特征，建立 应体系，根据病原菌 平在种间的变异特点，寻找到大豆疫霉菌的特异性 增条带 ，并 将其 转化为更为稳定方便的 记 。 在此技术的基础上 ，初步 建立大豆疫霉菌的快速检测技术体系。 研究获得的 主要结果如下： 1. 通过单孢分离技术，纯化 大豆疫霉菌菌株 34 个并鉴定了各菌株的毒力类型；培养其它卵菌 9个和大豆种传、土传真菌 23 个，为 本研究和其它相关研究奠定良好的病原学基础。 2. 建立了适用于大豆疫霉菌的 应体系；从 112 对引物中筛选出 56 对多态性引物，经过扩增，在引物对 得了对大豆疫霉菌的特异性扩增条带，其中引物对 大豆疫霉菌中能特异地扩增出约 660 片段，该片段用于进一步研究。 3. 将特异性扩增片段回收、克隆、测序、分析序列，根据序列特征设计引物。检测结果表明，已成功将该 记转化为 记。 4. 以 记引物进行特异性的 检测，能在大豆疫霉菌中稳定地扩增出大小约为 280 特异性片段，而其它参照菌中则无扩增。该 记的检测灵敏度达到 10 模拟实际检测中可能出现的情况，在 大豆疫霉菌 混入其它真菌的 能特异性地检测出大豆疫霉菌。 5. 通过对各技术环节的优化，初步建立了 大豆疫霉菌快速分子检测技术体系。 关键词 ：大豆疫霉菌（ 子检测 is an a on it is an In is to . on NA . is . a a . in as 1. 34 P. of 9 to 3 of in as in of 2. . 56 of in . in by A 660 bp 3. on a a in . It to a 4. a 280 bp in of . in of is 0 pg NA . 5. A . of 文缩略词 缩略词 英文全称 中文全称 mp GA NA , N, N, N增片段长度多态性 氨苄青霉素 碱基对 乙二胺四乙酸二钠盐 表达序列标签 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 数量性状位点 随机扩增多态性 制性酶切片段长度多态性 抗病基因同源序列 每秒转速 特征序列扩增区 单核苷酸多态性 简单重复序列 序列标签位点 三内切酶扩增的限制性片段长度多态性 N, N, N, N三（羟甲基）氨基甲烷 513 吲哚 录 第一章 引言 1 豆疫霉菌 . 1 用分子标记工具 . 2 记技术 . 3 记技术 . 3 记技术 . 4 记技术 . 4 记技术 . 5 记技术 . 5 记技术 . 5 物病原真菌的分子检测研究 . 8 豆疫霉菌的分子研究 . 9 究的内容和目的意义 . 10 究技术路线 . 11 第二章 材料和方法 . 12 验材料 . 12 豆疫霉菌 . 12 它卵菌 . 12 它真菌 . 13 豆疫霉菌生理小种鉴别寄主 . 13 养基 . 14 究方法 . 15 豆疫霉菌的分离 . 15 豆疫霉菌菌株毒力的鉴定 . 15 豆疫霉菌单孢纯系建立 . 15 验用菌的液体培养 . 16 因组 提取 . 16 析体系 . 17 异标记 段的克隆 . 21 序 ,物设计及筛选 . 23 记引物的检测 . 23 第三章 结果与分析 . 24 孢纯系的建立 . 24 豆疫霉菌单孢纯系 . 24 照菌的分离和培养 . 24 豆疫霉菌菌株毒力测定 . 24 V 因组 提取 . 25 应体系中的建立 . 25 切和连接条件的筛选 . 25 扩增条件筛选 . 26 择性扩增条件筛选 . 27 染程序 . 29 记的筛选 . 29 物的 回收扩增 . 30 收产物的克隆 . 31 序，设计引物 . 31 序 . 31 列比对分析 . 32 计引物 . 33 物的检测 . 33 异引物的初步检测 . 33 异引物的专一性检测 . 35 异引物的灵敏度检测 . 36 豆疫霉菌快速分子检测技术的构建 . 37 第四章 结论与讨论 . 38 论 . 38 建了适于大豆疫霉菌研究的 术 . 38 过 增，在大豆疫霉菌中发现了 3 条特异性标记的条带 . 38 将引物 增出的 记成功转化为 记 . 38 建了可以用于大豆疫霉菌快速检测的分子检测技术 . 38 论 . 38 参考文献 41 附录 46 致谢 51 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 豆疫霉菌 由大豆疫霉菌 大豆毁灭性病害之一，也是我国的重要对外检疫对象。该病于 1948 年在美国印第安那州首次发现。此后，加拿大、巴西、阿根廷、日本、澳大利亚等国家和欧洲、非洲地区相继报道了该病害的发生（ 1985）。在美国，大豆疫霉根腐病在发现不久后很快上升为重要性仅次于大豆胞囊线虫病的病害，造成极大的经济损失。 1989 年北京农业大学沈崇尧先生在我国东北地区首先发现了大豆疫霉根腐病。此后，一些研究者也相继在黑龙江省分离到大豆疫霉菌（周肇蕙等， 1995；李宝英和马淑梅， 1996；王晓鸣等， 1998）。至 1997 年，大豆疫霉根腐病已在黑龙江省的 29 个县（市）和 4 个国营农场发生，发病面积达 80000 公顷，成为危害黑龙江省大豆生产的新问题（韩晓增等， 1998）。近年的调查表明，大豆疫霉根腐病在我国 9 省（自治区）均有发生，其中在东北和黄淮大豆产区较为严重。 大豆疫霉菌可在大豆的任何生育阶段侵染大豆。在水淹条件下引起种子腐烂、出苗前死亡和出苗后钩状期死亡。苗期症状为植株近地表茎部出现水浸状病斑、叶片变黄萎蔫，严重时植株猝倒死亡。成株期植株受侵染后症状首先表现为下部叶片变黄，随后上部叶片逐渐变黄并很快萎蔫；近地表茎部病斑褐色，并可向上扩展至第 10 11 节位，茎皮层及髓变褐，中空，易折断；根腐烂，根系发育不良；未死亡病株的荚数明显减少，空荚、瘪荚较多，籽粒皱缩。成株期感病植株的病茎节位也有病荚产生，其症状为绿色豆荚基部出现水浸状斑，病斑逐渐变褐并从荚柄蔓延至荚尖，最后整个豆荚呈黄褐色干枯，种子失水干瘪，种皮、胚和子叶均可带菌。大豆疫霉菌为土传真菌，也能以卵孢子和菌丝体方式存活于大豆种子的种皮、胚和子叶内。大豆疫霉菌的致病性也受大豆植株生育期和发育状况的影响。 大豆疫霉菌为土传真菌，但病菌寄生性强，不能在土壤颗粒上竞 争生长和定殖，卵孢子在植株病残体和土壤中能存活多年。大豆疫霉菌在利马豆、玉米粉、 等培养基上生长较快，菌落均匀，边缘整齐。菌丝宽 3 9 m，易卷曲；菌丝体珊瑚状，分枝近直角，在分枝基部稍缢缩，老熟后产生隔膜；菌丝可形成结节状、膨大体和厚垣孢子。孢囊梗简单，顶生游动孢子囊；游动孢子囊倒梨形和椭圆形，无乳突；游动孢子卵圆形，一端或两端钝圆，侧面平滑，有两根鞭毛。周肇惠等（ 1996）研究证实卵孢子只产生于带菌种子的种皮，检测大豆种皮存在卵孢子与否可以作为大豆种子带菌检测方法之一。 1957 年， 现了大豆对大豆疫霉菌存在抗性分化。 1959 年 现不同大豆疫霉菌分离物在毒力上有差异，认为大豆疫霉菌存在生理株系。 1965 年 次报道了大豆疫霉菌的生理专化型，描述了 1 号和 2 号小种。 1963 年育成了含有单抗性基因 大豆商业品种，此后的十年间抗病品种在美国北部地区广泛推广种植，大豆疫霉根腐病得到了基本控制。但正是由于这些抗病品种的广泛应用，对病原菌造成相对高的选择压，加速了大豆疫霉菌的毒力分化。 1972 年， 美国北部地区发现对 当时推广的带有抗病基因的品种 有毒力的分离物，并定名为 3 号小种，随后 4 9 号小种也相继在北部地区和加拿大被鉴定。此后，在中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 抗病品种 小种互作下新的大豆疫霉菌生理小种便不断产生，其变异速度远远高于从 1 号、 2 号小种到 3 号小种的变异。有研究认为，在土壤中还可能存在更为丰富的生理小种多样性（ 1990），由于田间种植品种的同质性较高，存在于土壤中的许多小种尚不能通过田间发病植株分离来进行检测。大豆疫霉菌是具有寄主专化性的致病菌。已有的研究表明，大豆疫霉菌与大豆品种之间的互作具有基因对基因的特 征（ et 1995） 。在与寄主抗病性互作中，大豆疫霉菌 毒力也在演变和快速进化，新的生理小种不断出现，而且在大豆抗病性利用越多的地区，大豆疫霉菌的毒力变异就越快（ et 996） 。至 2000 年，通过在 13 个大豆疫霉菌生理 小种鉴别寄主上接种鉴定，国际上已报道了 63 个大豆疫霉菌生理小种 （ 1965; 2000） ，许多研究者还报道了更多的毒力基因类型。 事实上，一些研究者已直接从土壤中分离鉴别出许多新生理小种。大豆疫霉菌分离 物在实验室条件下，经过长时间的保存，也会在致病毒性上发生变异，产生新生理小种（ 2000）。 用分子标记工具 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。遗传标记可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行跟踪选择。在现代分子育种研究 中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。遗传标记可以分为形态标记、细胞学标记、蛋白质标记和 记。 根据对 态性的检测原理和手段，分子标记可大致分为以下四大类（张应华等， 2002）： 第一类为基于 交的分子标记。该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的 子，然后用经标记的特异 针与之杂交，通过放射性自显影或非同位素技术来显示 多态性。其中最具代表性的是发现最早的 记。 第二类为基于 分子标记。这类标记技术可以在短时间内将 少量的 品快速扩增，经过电泳并通过 色、银染、荧光标记、同位素标记或地高辛标记等多种方法进行检测其多态性的差异。根据所用引物的特点，这类标记可分为随机引物 记和特异引物 记。随机引物 记包括 记、 记等，其中 记使用较广泛。随机引物 增的段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物 记技术可用于对任何未知基因组的研究。特异引物 记包括 记、 记、 记等。特异引物 扩增的 段是事先已知的、明确的， 具有特异性，因此特异引物 记技术依赖于对各个物种基因组信息的了解。 第三类为基于 限制性酶切技术相结合的分子标记。这类标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，主要包括 记。另一种是通过 增片段的限制性酶切来显示扩增区段的多态性，如 记。 第四类为基于单个核苷酸多态性的分子标记。它是由 列中因单个碱基的变异而产生的遗传多态性，如 记。目前， 记一般通过 片技术进行分析。 下页表 1 汇总了常用的 态性分 析的标记。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 表 1 记技术一览表 of NA 文名称 文名称 文缩写 考文献 制性片段长度多态性 1980) 重复数可变串联重复 of 1987) 随机扩增多态性 1990) 任意引物 1990) 增指纹 1991) 简单序列重复间区 1994) 简单序列重复 1992) 特异性序列扩增 993) 序列标签位点 1989) 抗病基因类似物 1996) 扩增片段长度多态性 1995) 酶解扩增多态性序列 1993) 等位特异性 1990) 单链构象多态性 1992) 扩增长度多态性 1995) 专一性扩增多态性 1991) 单核苷酸多态性 1998) 其中应用最广泛的标记主要有下面介绍的几种。 记技术 限制性片段长度多态性（ 这一方法由 1980年 首先提出。该方法的出现开创了直接应用 平遗传标记的新阶段。 术采用限制性内切酶消化基因组 于限制性酶切位点 (靶位点 )列的点突变，或两相邻靶位点之间 列的插入、缺失，都会改变相应 段的长度。这种长度上的差异 (多态性 )通过电泳分离和分子杂交检测就形成一种可视的标记。 1987 年 构建了第一张人类的 记技术 在多聚酶链式反应（ 术的基础上建立起来的一类 1990 年 采用长度为 9碱基的随机核苷酸序列为引物扩增基因组 得随机扩增的多态性 其称为 记形成的遗传学基础是： 位区域内，或因引物结合序列发生点突变，使扩增子（ 个反向聚合的引物靶序列）丢失，产生显性效应的 记；或因扩增子间发生序列的插入，缺失突变，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 产生共显性的 记。由于扩增子较小，一般在 2 下，在这种长度范围内发生插入和缺失突变的机会很小。因此， 记主要以引物结合序列发生突变形成显性分子标记居多。 与 比， 析所需的基因组 很少，对 备的纯度要求不高，微量快速的 离方法就能满足 增的需要。 析的程序也简单，不涉及放射性同位素。物是 量在 60%以上的随机引物。一般认为 记适合检测整个基因组 位区域内变异，但有一些研究发现， 记在染色体基因组中存在不均匀分布的现象。 在的主要缺陷是使用的引物长度较短，一般为 9碱基，为了增加引物与模块结合的能力，使用较低的退火温度，并且允许一定程度的碱基误配。因此， 扩增反应的条件非常敏感，被认为是稳定性较差的一种标记。 记技术 次由 1993）提出并应用。它是通过对多态性 物测序的基础上，设计一对新的引物特异地扩增一个在遗传上定义为一个位点的 段，一般在原 物的 3与 5端延长 14 个碱基，利用两端各 24 个碱基的引物进行特异扩增。因此，与 比， 法（ 1）由于使用长引物和高退火温度，具有高稳定性。（ 2）具有转化显性 记为共显性的 记的可能性。（ 3）如果为显性的话，可以直接染色检测。 一种典型的特异扩增反应，是目前能将 记转化为稳定标记的较少方法之一。基于上述优点， 记成为目前分子标记在实践中能直接应用的首选标记。在近几年开展的抗病基因标记研究中，许多研究者均将 记转化为 记，并在转育后 代中得到了较好的验证（许勇， 1999）。 记技术 基于 展起来的一类 记技术， （ 1989)首先在人类基因组的物理作图研究中使用 术， 术的基因原理是，对 记使用的克隆 (多为 行测序，根据序列信息设计一对引物，用于对基因组 行特异扩增，对扩增产物进行常规的 泳检测扩增产物的多态性。进行 物设计时一般选择 行测序，测多态性的基础是 为一种表达的基因组 其内部存在许多易发生插入、缺失等突变的非表达区域，从而使得与两引物配对的区域形成的扩增子，表现多态性。 为一种基于 标记技术，显然具有 法比拟的实用上的可行性，但是，并非所有的 点都可以找到对应的 记。 基于 术，首先必需要求引物配对区域之间的 度满足 增的条件，形成一个扩增子。但实际上许多插入序列远超过扩增子的大小，使 增无法得到产物。 这类 记就无法转化为 记。另外， 记并非总能与相应的 记相对应。有 些引物扩增的产物则没有长度上的多态性。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 记技术 称为微卫星（ 广泛存在于植物基因组中，一般是一组由一至六个碱基对序列串在一起的序列的重复。这种简单序列的重复次数存在丰富的多态性，并广泛分布于整个染色体组中。 端有一段保守的 列，通过这段序列可以设计一段互补的寡聚核苷酸引物对 行 增。由于 态性仅是由简单序列的重复次数的差异引起的，通常表现为共显性。 增产物的检测通常采用高浓度的琼脂 糖胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 记技术 生物学基础仍然是植物基因组中存在的 检测首先需要获得 侧保守的 列才能设计引物。为了获得这段保守的序列信息，需要大量分离 测序的工作。 利用植物广泛存在 特点，利用在植物基因组中常出现的列本身设计引物，无需对克隆测序。 物通常是一段长度在 15右的一段简单重复序列，