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鸡 的 切 片 制 作实 验报告 实验三 病变组织的取材、固定和修块一.实验目的掌握用于病理组织学诊断的组织材料的取材原则，固定方法及修块标准。二实验耗材手术刀、组织剪、刀片、生理盐水、多聚甲醛固定液（福尔马林）、铅笔等。三实验过程1.取材：用颈部放血法处死公鸡，打开腹腔，取需要的组织。切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm*5mm*2mm或10mm*10mm*2mm为宜。取下所需的组织，切成一小块2-3mm厚。注意：取材动作要迅速。不宜做太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，不要损伤所需要的部分。2. 固定：将切好的内脏组织用 生理盐水把组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定。（固定的作用）组织经一系列的处理后，就必须进行固定。固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。3. 修块样品要求：长，宽各1cm左右，厚不宜超过1cm（依据组织不同要求不同）。肝、肾、脾、肺、肌肉、消化道、脑其他注意（1）组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。（2）固定材料时，固定液必须充足，一般材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。（3）组织固定，组织块不宜过大。对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。（4）对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。（5）组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。（6）特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。（7）有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才能混合，如果混合太早，固定就没作用了。如Zenker液（一种核固定剂），最适合于造血和网状内皮组织的固定。实验四 组织的脱水处理一实验目的掌握组织脱水的目的和原理，及在实验过程中的注意事项。二实验耗材75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精。三、实验步骤原理： 用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。脱水概念：把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。（脱水过程）1、水洗：将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下水洗，水洗时间依固定时间而定，一般12h以上，固定时间越长水洗时间越长。2、脱水1）75%酒精 12h2) 85%酒精 6-8h3）95%酒精 12h4) 100%酒精 2h5) 100%酒精 2h组织块在进入下一阶段梯度酒精前要用吸水纸吸干水，尤其在95%酒精中进入100%酒精（）中，切记防止带入水分，所有过程要在瓶口加盖，防止水分子进入。（脱水的基本原则）从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时即可达到完全脱水。在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到24小时也能获得满意的结果。但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。实验五 组织的透明、浸蜡和包埋一实验目的了解透明、浸蜡原理，掌握透明、浸蜡和包埋的方法。二实验材料二甲苯、西林瓶、二甲苯：石蜡=1:1、石蜡、烘箱、包埋框、标签纸、铅笔等。3 实验过程1. 透明透明主要是萃取可溶性有机物质。由于乙醇和石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过度。先用二甲苯浸泡1.5-2小时，然后在放入二甲苯中浸泡，同时观察透明程度。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同的透明状态后可立即取出，浸泡过久的组织则会变脆。2. 浸蜡将处理好的材料置于1:1石蜡二甲苯混合物2.5h，再放入石蜡30min。浸蜡的目的是除去组织中的透明剂，使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度，以便包埋。浸蜡时间根据组织大小而定。浸蜡应在恒温箱中进行，温度保持在55-60左右，温度过高会使组织发脆。3. 包埋和修块将60的纯蜡迅速倒入包埋盒内，再迅速将浸蜡后的组织放入，一定要注意将平整的组织切面朝下，并将标签一同放入包埋盒，待石蜡全部凝固后取出。整个过程要迅速，防止蜡凝固过快，或组织倾斜，不利于切片。将包埋好的组织蜡块进行修整，削去组织周围的蜡块，整体与木块大小相适应，将标签贴在蜡块侧面，用灼烧过的刀片将标签微嵌入蜡块中，以便于切片。实验六 组织切片技术1 实验目的熟悉切片机的使用方法，掌握切片厚度，捞片技巧，烘片温度的控制及时间等。2 实验器材切片机、蜡块、毛笔、刀片、镊子、烘箱、水浴锅、载玻片、蛋白甘油等。3、 实验过程1. 切片 将组织蜡块装在切片机的夹物台上，将切片刀安装在刀夹上。摇动螺旋使蜡块贴近刀片，调整蜡块和刀口的角度与位置，调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为5微米。在正式切片前先微修，以约20微米切去组织前的石蜡，直至组织切面露出为止。切片时右手转动转轮，让蜡块切成蜡带，约有3-4片组成。左手持毛笔将蜡带提起，并牵引成带，放在水浴锅中（34恒温）。当组织在水面上展平后，进行捞片。2. 捞片将载玻片提前抹好适量蛋白甘油，确保组织完全贴附在载玻片上，在组织一侧，将载玻片垂直插入水中，用镊子轻轻拨动组织，使组织靠近载玻片，并成功贴附在上面，并对其进行标记，放入45烘箱中烘片。注意事项取清洁的载玻片，滴粘片剂于玻片中央，用洗净的手指抹匀。滴12滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。用小镊子辅助，将在水中展平的蜡片捞至玻片上，并粘贴标签。将玻片置于预先加热的展片台上（温度保持在4045），使蜡片因受热而伸展摊平。展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于45温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。实验七 HE染片的制作一实验目的熟练掌握HE染色步骤及染色原理。二实验材料二甲苯、二甲苯、100%酒精、100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、苏木素、伊红、盐酸酒精、氨水、染色架、烧杯、光学显微镜等。3 实验过程（1） 脱蜡1 二甲苯 （脱蜡） 15min2 二甲苯 （脱蜡） 15min3 100%酒精 （脱二甲苯） 7min4 100%酒精 （脱二甲苯） 6min5 95%酒精 （脱二甲苯） 5min6 85%酒精 （脱二甲苯） 4min7 75%酒精 （脱二甲苯） 3min8 自来水或蒸馏水洗（去酒精） 5min（二）染色9 苏木素染液 23min10 冲洗 清水（蓝化）15min11 盐酸酒精酸化 视情况而定 5-10s12 氨水 视情况而定 5-10s13 冲洗 淡蓝色即可 20min14 伊红染液 视情况而定 1min（三）脱水，透明15 75%酒精 颜色淡化2-3s16 85%酒精 2-3s17 95%酒精 2-3s18 100%酒精 2min19 100%酒精 5min20 烘箱烘干21 二甲苯 （透明） 5min22 二甲苯 （透明） 15min23 封藏 中性树胶24 烘干 烘箱注意事项：1、脱蜡复水染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。2、染色染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。3、水洗冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。4、分化 将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。5、 漂洗 切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。6、复染 伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。7、封藏：中性树胶封存 切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。实验八 病理组织学诊断及照相一实验目的通过在显微镜下观察，了解各种组织器官的组织形态学结构，并使用数码显微照相系统对典型病变拍照。二实验材料光学显微镜、组织切片、擦镜纸等。3. 实验内容1、 用学生用Olympus显微镜观察各组织的病理组