【毕业学位论文】（Word原稿）苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用-药学

题目 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 作者姓名 赵 帅 指导教师 吴 元 明 二级学院 医 学 院 专 业 药 学 学 号 9安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 I 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 摘 要 本研究采用聚合酶链式反应（ 增和测序方法对一个确诊的苯丙酮尿症（ 系的苯丙氨酸羟化酶（ 6基因序列热点突变位点及分布特征进行研究，优化了苯丙酮尿 症致病基因检测方法。结果表明：家系中父亲和母亲是苯丙酮尿症致病基因 突变携带者，儿子同时遗传了父亲和母亲的突变基因，导致其患病，是典型的 系，本研究为苯丙酮尿症患者产前诊断、治疗、遗传咨询、优生优育奠定基础有重要意义。 关键词 ： 变热点 西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 of - in of in AH of of at to of an 安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 录 引 言 . - 1 - 1 实验材料 . - 3 - 本来源 . - 3 - 要试剂 . - 3 - 要仪器 . - 3 - 2 实验方法 . - 4 - 取 . - 4 - 增 . - 4 - 应体系 . - 4 - 应条件 . - 4 - 脂糖凝胶电泳 . - 5 - 脂糖凝胶的制备 . - 5 - 板的制备 . - 5 - 样 . - 5 - 泳 . - 6 - 察 . - 6 - 序 . - 6 - 计学分析 . - 6 - 3 实验结果 . - 6 - 4 讨论 . - 8 - 结 论 . - 9 - 参考文献 . - 10 - 致 谢 . - 12 - 附 录 . - 13 - 西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 1 - 引 言 苯丙酮尿症 （ 一种氨基酸代谢异常的遗传病。因其致病基因在常染色体上，所以发病几率和性别无关 1。根据发病机制不同，学者把苯丙酮尿症分为两个类型，一类是典型 因是苯丙氨酸羟化酶（ 因突变导致苯丙氨酸羟化酶缺乏所致，占 全部疾病的 98% 99% ； 另 一 类 是 四 氢 生 物 喋 呤 缺 乏 症（ 病因是苯丙氨酸羟化酶的辅酶，四氢生物喋呤（ 乏所致，占 1% 2%。 主要临床表现为，皮肤色浅、头发细黄、虹膜淡黄色，同时尿有 “发霉 ”臭味或鼠尿味，智力低下；而且 60%患儿有脑电图异常和继发性癫痫 2，严重者甚至可能导致死亡 3。 苯丙酮尿症在全世界有广泛的发病几率，但也因地区及种族有明显差异，发病率总体约为 1： 500 1： 100004。有文献报道，苯丙酮尿症发病率白种人大于黑种人和黄色人种。其中 ： 26005、 为 1： 14000、 为 1： 4400、 为 1： 7000、 为 1： 784006。根据国家新生儿筛查中心（ 供数据显示，我国新生儿苯丙酮尿症发病率为 1/11 5727。而陕西省 2004 年 2009 年的新生儿的苯丙酮尿症发病率高达 1/3425。也有文献报道我国 病存在着北方高于南方，东部地区低于中部和西部地区的特点 8。苯丙酮尿症作为可治疗的遗传代谢性疾病之一，若能达到早诊断、早治疗，就能有效地控制该病的发生与发展，最大限度地减少社会和家庭的负 担，为提高我省人口素质具有一定意义。 致病基因的发现可以追溯到 1983 年，苯丙氨酸羟化酶（ 因被成功分离、克隆 9。苯丙氨酸羟化酶（ 因位于常染色体 约由 基组成。 因是割裂基因，编码区包含 13 时被 12 分隔。转录时剪接 成仅包含 1353单链，即包含 451 密码子的可译框。信使核糖核酸（ 翻译成含 451 氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的 10,11。截至 ，国内外已发现 564 种突变（ ）。 因的突变大部分位于编码区的基因的突变，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 2 - 对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置，根据对苯丙氨酸羟化酶酶活性有无影响，突变又可分为致病突变和沉默突变。致病突变大多位于 ，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。沉默突变对苯丙氨酸羟化酶活性无影响。 苯 丙酮尿症中 5 种重要的酶参与辅酶四氢生物喋呤的合成或代谢循环，可以说其中任何一种酶基因的缺陷均可导致 乏型 非经典型苯酮尿症 ,也称恶性苯酮尿症 )。 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等三种芳香族氨基酸羟化酶作用所必需的辅助因子，而 66合成 关键酶之一，其缺陷是 乏型 最常见病因。尽管经典 发病率低于西方人，但有调查表明我国汉族人群 乏型 西方人为多 12。 追溯到 1986 年就有通过生化手段进行 乏型 产前诊断的报道，但因羊水中的生物蝶呤极不稳定 ,学分析方法较复杂而使其应用受到限制 13 66 成必需的催化酶， 最主要原因。 长约 9 有 6 个 码 145个氨基酸，已报道的突变主要分布在 5、 6。 苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶 和 6 1）突变位置多变：所有 5 3 均发现突变 。（ 2）突变类型多样：有错义突变（ 、小缺失突变（ 、剪接位点突变（ 、沉默突变（ 7%）、无义突变（ 、小插入（ 1%）、大片段插入罕见（ A，母亲的突变位点是 ，儿子分别遗传了父母的突变基因，为复合杂合突变类型（见表 3其中 本 次 研 究 新 发 现 （ 图 3C）， 在 国 际 据 库（ ）中尚未报到，提交并已被国际 因突变数据库收录。另一苯丙酮尿症致病基因 家系中均未检测到突变。 表 3苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶基因突变检测结果 姓 名 核苷酸改变 蛋白质改变 突变位置 突变类型 父 亲 - 剪接 母 亲 错义 儿 子 - 剪接 错义 图 3变检测的测序结果。红色箭头所指为 突变位点。 A：父亲； B：母亲； C: 儿子。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 8 - 图 3变检测的测序结果。红色箭头所指为突变位点。 A：父亲； B：母亲；C: 儿子。 4 讨论 因的突变大部分位于编码区的小的遗传学变化，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置。根据突变类型对 活性的影响情况，突变可分为致病突变和沉默突变两种。沉默突变对 活性无影响。致病突变大多位于 重影响 合，以及加速降解，从而影 响 催化活性 19。本研究共发现了 2 种突变，包括 1 种错义突变和 1 种剪接位点突变。其中剪接位点突变和由于直接影响了蛋白的转录或翻译，通常被认为是致病性突变，而错义突变的致病性质是需要经过体外表达、蛋白结构分析等进一步研究证明 20。 本研究的家系中 因没有显示突变，由于 陷所致 病率低，对一个家系而言突变是相对固定的。但是对于 陷症进行产前基因诊断，可以对先证者和父母的突变分析的基础上，选择合适的分子生物学手段，如以 工增加限制酶位点、 列分析和最新发展的 片等技术，这样就可以对绝大多数 陷症进行产前基因诊断。 本课题对 者 因和 因突变位点的探讨，为家系 有效降低 病率，提供可靠科学依据，对减少 儿的发生，提高人口素质具有重要意义，同时也为深入开展 基因诊断、产前诊断以及今后的基因治疗奠定了基础。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 9 - 结 论 任何疾病的发生都是遗传物质和环境因素相互作用的结果。人类疾病基因和相关基因的定位、分离和克隆，为现代医学带来了空前的机遇。基因诊断是伴随着遗传学和细胞分子生物学理论和技 术迅速发展而产生的一种新型诊断技术。在 病诊断过程当中，基因诊断为进一步的产前诊断，疾病筛查奠定基础，将向着高稳定性、高可靠性、高效率以及快速简便经济的方向发展，相信最终将会造福人类。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 10 - 参考文献 1 顾学苑 ,新生儿筛查现状和展望 J,广东医学 ,21(7):212 顾学范 ,苯丙酮尿症的诊断和治疗 ,广东医学 ,2000,21(7):5353 M,is in to of J003,17(3):4584 L C, S, D, H,of 983,306:1515 an of 008)316 R, J,Co , a 000,15:997 R , J,003:a 003,21:333 8 罗超权 M1 版 ,河南 :河南医科大学出版社 ,2000:799 ,of in a of 003,33(3):30110 顾学范 实用儿科临床杂志 ,2000,15(5):29711 王慕逖 人民卫生出版社 ,1996:14012 J, H, T et by C, , , of 989. 1990,40213 , , , et a of 986, 145:176 14 , et J 1989, 12 :29515 , , , et C, , , of 989. 1990. 40816 R, J,a 安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 11 - 003,21:33317 a, b, c, et 009,97:165171. 18 u, et of 998,11: 7619 003,21(4)： 34520 ,a in 003,526(145西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用 - 12 - 致 谢 本研究是在我的导师吴元明副教授的悉心指导下完成的。他渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使 我明白了许多待人接物与为人处世的道理。在此，谨向吴老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！ 感谢第四军医大学实验室提供了良好的环境，保障论文顺利完成，感谢实验室各位老师给我的帮助