活体生物发光和荧光成像技术应用讲座2016,7

1 活体生物发光和荧光成像技术应用介绍 wanchunli QQ1055873363021 68569108136518865492016年7月8日 2 仪器结构与组成 3 NightOWL LB983 新一代分子成像设备NightOWL LB983具有强大的活体组织发光影像分析能力 无论是对BLI荧光素酶系统产生的弱光信号还是BFI荧光染料或荧光蛋白所发出的荧光影像信号 NightOWL LB983都能为使用者提供可靠的清晰的检测结果并配有强大的科学分析软件对数据进行处理 4 视野连续可调 自动聚焦 3 5cm 75cm 焦距 cm 分辨率 m 3 55075320 5 3种荧光激发光源配件环状照射装置鱼尾型照射装置鹅颈管照射装置散射光滤光片90W钨灯光源200 1100nm可选滤光片 荧光成像配件 6 气体流量计 麻醉气体蒸发器 诱导麻醉箱 输送管道 麻醉机组成 7 祛除宇宙射线和背景视野校准定量分析功能原始数据与处理后数据分开存档 根据GLP规则 三种图像输出模式 indiGoTM 功能强大的软件 伪彩图 灰度图 真彩图 8 成像原理与特点 9 目前的活体生物体内成像技术和方向 可见光及荧光成像 生物发光 Bioluminescence 与荧光 Fluorescence 正电子衍射成像 Positron EmissionTomography PET 放射性标记葡萄糖导入体内 被分裂旺盛组织吸收 常用于检测肿瘤的良恶性单光子衍射 Single Photon EmissionComputedTomography SPECT 超声 Ultrasound 物理学方法计算机断层摄影 ComputedTomography CT 断层扫瞄技术 X ray的衍生 物理学方法核磁共振 MagneticResonanceImaging MRI 包括功能性核磁共振 FunctionalMRI fMRI 心血管核磁共振 Cardio vascularMRI cMRI 等等 10 几种常用活体体内成像技术的比较 结构成像 功能成像 操作复杂 操作简单 MRI核磁共振 OpticalImaging可见光成像 PET SPET正电子衍射 Ultrasound超声 CT 11 理想的光源 萤火虫荧光素酶 luciferase 基因 细胞 活体都可被荧光素酶基因标记 活体生物发光成像系统原理 遗传学标记 实时 原位 多波长检测 标记癌细胞 标记细菌 标记转基因鼠 12 荧光素酶的表达 将荧光素酶基因连接于启动子下游 稳定整合到细胞染色体内 使荧光素酶得到持续表达 启动子 染色体 体内表达 外源注入底物 活跃细胞 体内发光 13 标记细胞发光强度与定量分析 14 小鼠皮下总计1000个细胞或每mm 20个细胞可以很容易地被检测到 探测极限是一丛150 250个细胞 生物发光活体成像方面的灵敏度 15 在微孔细胞板中少到10个细胞可以检测到 生物发光微孔板检测的灵敏度 16 如何提高灵敏度 NatureMedicine2011年1月 17 平均肿瘤体积 平均相对光单位对数值 生物发光光子数与肿瘤体积呈正相关 1x106 PC 3M Luc肿瘤细胞 皮下注射 18 生物发光的应用 19 活体成像技术的主要应用 标记细胞癌症及药物研究 标记病毒 DNA RNA病毒学及基因治疗 转基因动物模型 蛋白质相互作用 代谢 发育 内分泌学 等等 标记基因 siRNA研究的应用 干细胞 免疫 其它 细胞凋亡 组织特异性基因表达 标记细菌 20 体内药物分析的生物发光检测 1x106 PC 3M Luc肿瘤细胞 皮下注射 14天 21天 28天 35天 雄性SCID小鼠 处理方式细胞数 无治疗对照2 2x109 5 FU治疗2 8x108 丝裂酶素3 6x106治疗 小鼠 6n 7 小鼠 40n 8 从第11天开始给药 小鼠 31n 8 从第11天开始给药 21 对照组于第五周结束观察 生物发光强度 Exp 081雄性nu nuCRn 13 5 7 n 13 n 6 7 n 3 5 生物发光检测体内药物治疗的复发作用 5x105 PC3M Luc C6肿瘤细胞 原位前列腺癌 1周 3周 5周 7周 8周 生理盐水对照组 小鼠 40 静注 3次 周 第二 三周 5 Fu治疗组 小鼠 38 100mg kg静注 1次 周 第二 三 四周 丝裂酶素治疗组 小鼠 4 2mg kg静注 3次 周 第二 三周 22 肺癌模型 A549原位肺癌NIH2010 23 乳腺癌原位接种 PNAS2010 10 24 原位胰腺癌模型 2010 25 白血病模型 2 105Arf p185 luc LICs 2011年9月BLOOD 26 BCL6enablesPh1acutelymphoblasticleukaemiacellstosurviveBCR ABL1kinaseinhibition2011年5月NATURE 45678接种后周数 27 U87脑胶质瘤成像cancerresearch2011 8 PTAofU87humangliomasinmousebrains A representativebioluminescenceimagesofnudemicebearingU87 TGLtumorswithdifferenttreatments seeMaterialsandMethods 28 骨肉瘤转移机理研究 第九人民医院 29 肿瘤转移 30 乳腺癌转移实验 中科院健康所2011 31 利用转基因技术自发肿瘤的研究 MYCinactivationuncoverspluripotentdifferentiationandtumourdormancyinhepatocellularcancerNATURE2004 32 cancercell2004 10 抗癌药物的临床前研究 33 抗体药物研究 CD137stimulationenhancestheantilymphomaactivityofanti CD20antibodies 2011年10月BLOOD 34 研究干细胞造血作用 Caoetal PNAS2004 PercentGFP Cells corrected 80706050403020100 FVBN1N2N3N4N5P1P2P3P4P5P6 TotalleukocytesGranulocytesBcellsTcells DonorlinecrossedtoFVBCg TgaGFPTgline 35 心脏内成像 BMCswithgreenfluorescentprotein FLucwereadministeredthroughthetailvein24hoursaftermyocardialinfarction BLIdemonstratedagreaternumberofBMCshomedtotheperiinfarctregioninthedouble knockdowngroup withpeakhomingatday7 36 免疫治疗研究 EDINGERetal 2003 blood TraffickingofCIKcells 37 当共转染pGL3 luc或HCV luc表达载体特异的siRNA时 可抑制报告基因Luciferase的表达 McCaffreyetal Nature 408 38 39 2002 CopyrightpermissionfromNaturepublishinggroup 抑制荧光素酶 pGL3 control 抑制丙型肝炎病毒 pShh1 Ff1 38 外源质粒在体内表达 中国军事医学科学院2010 质粒pGL3 LUC质粒 通过水动力方法注入小鼠体内后 在肝脏中与luciferase反应后大量表达 39 实验性心内膜炎症的抗生素筛选大鼠模型 对照组 vancomycin vancomycin cefazolin gentamicin 40 细菌的感染模式研究 MembranousCellsinNasal AssociatedLymphoidTissuetheRespiratoryMucosalPathogenGroupAStreptococcus1 41 基因治疗载体的构建 AdTSTA FL的表达活性比AdCMV FL高100倍以上 AdTSTA FL 107 AdCMV FL 107 Days571013 103 105 42 AgeneticallyhumanizedmousemodelforhepatitisCvirusinfection NATURE2011年6月 43 体内蛋白质 蛋白质之间的相互作用 LUCN端与C端分开时并不发光蛋白质A与蛋白质B分别与LUCN端和C端连接两组蛋白由不同的质粒诱导表达 蛋白A 蛋白B LucN端 LucC端 蛋白A 蛋白B Luciferase 发光 相互作用 44 活体动物体内观察细胞凋亡 LUC I I LUC I I Laxman etalPNASV 99 Caspasesite Caspasesite 发光 Apoptosis Caspase表达 45 活体动物细胞及组织特异性基因表达 构建双重标记的细胞株 RENILLA FIREFLYLUCIFERASE 识别不同底物的发光酶研究基因的启动子控制FIREFLYLUCIFERASE表达 与兴趣基因平行表达 RENILLALUCIFERASE作为内参 标记细胞数量 RENILLALuc FIREFLYLuc Pc RenLuc FirLuc P53 发光 发光 46 荧光和量子点标记的应用 47 4H9在荷瘤小鼠中的分布 U87V3 50 gcy5 5labeled4H9 i v 2hr 6hr 24hr 仰卧 右侧卧 48 GFP标记的肺癌皮下模型 NightOWL LB983上海肿瘤研究所2007年 第1周 第2周 第3周 第4周 49 药物的肿瘤靶向性研究 复旦药学院2007年11月 荧光染料标记药物载体 识别未标记的肿瘤 50 荧光染料 Cy5 5 标记的探针对肿瘤细胞的识别 NightOWL LB983上海肿瘤研究所2007年 51 量子点标记成像 注射部位 右侧前爪皮下注射 量子点聚集区域 腋下淋巴结 利用gooseneckspotillumination作为激发光源 光能40 52 转基因动物的应用 53 基因激活表达生物发光 研究者可通过观察动物模型的生物发光 判断靶基因是否表达 既基因的 开 关 现象 转基因动物模型原理 生物大分子合成 54 血管内皮细胞生长因子受体2 Vascularendothelialcellgrowthfactorreceptor2 VEGFR2 是VEGF的同源受体 VEGF在血管生成过