【毕业学位论文】（Word原稿）水稻稻瘟病抗性新基因的鉴定与定位研究作物遗传育种硕士论文

密级： 内部 5 年 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 水稻稻瘟病抗性新基因的鉴定与定位研究 of a in 5 of a in I 摘 要 稻瘟病（ 由子囊菌 无性世代为 引起的最严重的水稻病害之一，广泛分布于水稻栽培的国家和地区。挖掘和利用广谱抗性基因 是当前控制稻瘟病的重要措施。 一个来自云南的地方粳稻品种，对我国不同稻区的 140 个强致病力菌株都表现高度抗性，其抗谱强于广谱抗性基因 。本研究以普感品种 本，感病）和本，抗病）配制的杂交后代 4 个广 致病谱菌株 9998095(四川 26( 97 鉴别 菌株，对 抗稻瘟病 基因进行了遗传分析和精细定位。 利用菌株 四川 26 和 97种 ， 别出现 63： 1 和 15： 1 的抗、感分离比例 ， 表明这两个菌株 的抗性分别由 3 对和 2 对显性抗性基因控制，而 利用 菌株 99 98095 接种 ， 出现 3： 1 的抗感分离比例，表明 这两个菌株的抗性均由 1 对显性抗性基因控制。利用由 1158 个 3株系组成的 种菌株 99 98095，其纯合抗病、抗感分离和纯合感病株系 的 分离也符合一对基因的分离模式，这表明 9998095 两个菌株的抗性可能为同一个基因所控制。 采用 析的方法，用 876个对菌株 992单株和 732株对菌株 98095 极端感病的 99 98095 的抗性基因都定位于 据这一基因定位结果，结合前面利用 们推定 t)和 t)实质上是同一对基因，暂命名为 t)。 利用 2817个感病 抗稻瘟病 基因 t)精细定位在第 4染色体短臂末端 标记 间的 65段内。在水稻第 4 染色体短臂上，迄今还没有相关 抗稻瘟病 基因和位的报道，只在 该染色体长臂上报道了 1 个隐性基因 t)和 3 个抗性 它们距离 t)至少 20 上。因此，确定 本研究定位的 t)是一个新的广谱 抗稻瘟病 基因。 根据测序品种日本晴的序列，利用 ） 、 ）以及 ）在标记 间的 65段内 进行侯选基因预测分析，结果确定 抗稻瘟病 基因 t)的候选基因 ，为 t)基因的克隆奠定了基础。 关键词 ：水稻，稻瘟病，抗性基因，精细定位，稻瘟病菌 is of of of or is to be a a to at 40 a In we NG by 2 3 a TH x 9 98095 ( 6 (7 1 NG to 98095 be by to 76 by it be NG at We 76 F2 to 932 F2 to 8095 to 98095 a 2.6 cM by SR on in of by SR NG to is by t) We 817 2 a 65kb by to no on of , we t) is a on NA we t) by of ), 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 增子长度多态性 菌人工染色体 交 物信息学分析 池分析法 切扩增多态性序列 摩 六烷基溴化铵 增指纹 单倍体 氧核糖核酸 二胺四乙酸二钠 入 /缺失多态 际水稻基因组测序计划 江新团黑谷 丙烯酰氨凝胶电泳 聚酶链式反应 数量性状位点 机扩增多态性 性集团分析 制性酶切片段长度多态性 性基因同源序列 组自交系 异扩增子多态性 二烷基硫酸钠 核苷酸多态性 链构象多态性 单重复序列 /微卫星 定序列位点 录 第一章 绪论 . 1 1 水稻抗稻瘟病基因的定位与克隆 . 1 稻抗稻瘟病基因的定位 . 1 瘟病抗性基因克隆 . 7 2 稻瘟菌无毒基因的定位与克隆 . 8 瘟病菌遗传图谱与全基因组测序 . 8 瘟病菌无毒基因的分子标记 . 9 3 水稻抗稻瘟病分子育种 . 10 稻瘟病基因的分子标记辅助选择 . 11 抗稻瘟病基因育种 . 11 第二章 广谱抗源 稻瘟病基因 t)的鉴定与定位 . 12 1 实验材料 . 12 稻材料 . 12 瘟病菌株 . 13 2 实验方法 . 13 性遗传分析与基因定位群体的构建 . 13 瘟病菌分离与培养 . 13 种与育苗 . 13 种与病情 调查 . 14 稻基因组 提取 . 14 其产物的检测 . 15 标记的开发 . 16 记与抗病基因的连锁分析 . 17 3 实验结果与分析 . 18 稻瘟病基因的遗传分析 . 18 稻瘟病基因的初步定位 . 21 t)基因的精细定位 . 23 t)属于新的抗稻瘟病基因的确认 . 25 抗稻瘟病基因 t)的侯选基因预测 . 26 第三章 讨论和结论 . 28 1. 云南地方稻种抗稻瘟病基因的发掘与利用 . 28 2. 抗稻瘟病基因的定位策略 . 28 稻瘟病基因定位群体的选择 . 28 V 物信息学分析技术（ 应用 . 29 3. 目的基因的预测 . 29 4. 本研究的主要结论 . 30 参考文献 . 31 致谢 . 39 个人简介 . 40 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 绪论 由稻瘟病菌 起的稻瘟病 （ et 1994） ，是一种世界性的水稻病害，严重影响了水稻的产量和质量 (1985)，目 前至少已有 80 多个国家和地区报道过发生稻瘟病，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约为 11% 30%，价值 et 1997； )。在我国，凡有水稻栽培的地方 稻瘟病 都有不同程度的发生。上世纪 90 年代以来，我国稻瘟病年发生面积平均在 400 万公顷左右，损失稻谷在数亿公斤 （董继新等 , 2000） 。仅湖南地区，由于稻瘟病引起的稻谷损失每年平均在 2 亿公斤以上。稻瘟病分布的广泛性和危害的严重性引起了世界各国政府和科学家 的广泛关注。 目前，在生产上一般采用化学防治和种植抗性品种来控制稻瘟病害。通过化学防治手段虽然能发挥一定的防治作用，但在病害流行年份，感病品种即便多次施药也效果甚微，还容易造成环境污染。长期的生产实践证明，选育和利用 抗稻瘟病 品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施，也符合人类对绿色食物的要求 （ et 1997） 。培育抗病品种的首要任务是发掘抗源和鉴定抗性基因，为此，世界上主要产稻国几乎都投入大量人力、物力开展稻瘟病抗性遗传与稻瘟病菌致病性变异等研究，迄今已鉴定和定位了一大批水稻 抗稻瘟病 基因和病原菌的非致病性基因，并克隆了部分 抗稻瘟病 基因和非致病性基因，为阐明水稻稻瘟病菌互作、抗病性分子机制奠定了基础，也为有效利用稻瘟病抗性基因，开展抗病基因工程和分子育种，培育广谱或持久 抗稻瘟病 水稻品种做了物质和技术准备。 本章概述了科学家们在水稻 抗稻瘟病 基因及稻瘟病菌无毒基因的定位、克隆以及水稻抗病育种方面的研究概况。 1 水稻 抗稻瘟病 基因的定位与克隆 稻 抗稻瘟病 基因的定位 稻 抗稻瘟病 性类型 水稻对稻瘟病菌的抗性大致可分为两类，即是质的抗性（或称真抗性、完全抗性、主效基 因抗性等等）和量的抗性（或称田间抗性、部分抗性、微效基因抗性等）。多数水稻品种的抗性属质的抗性，受 1对或几对主效基因控制，呈显性或不完全显性，亦有个别呈隐性的。也有一些品种具有一定的量的抗性，在田间表现为发病轻或减缓病害发生，涉及到微效基因的作用。一般而言，主效基因具有很强的小种专化性，决定品种的抗感差异，但易因病原菌无毒基因的变异而丧失抗性；微效基因专化抗性相对较弱，往往与病斑大小和病斑数量等性状相关，抗性相对稳定。主效抗性基因与微效抗性基因的结合，对维持水稻品种的持久 抗稻瘟病 性具有积极作用。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 稻主效 抗稻瘟病 基因定位 早在上世纪 70 年代，日本学者 用经典遗传学方法鉴定出 8 个位点上的 14 个主效显性抗病基因，包括 点的 点的 及 et 1990） 。 80 年代后期以来，随着分子生物学的迅速发展，各类分子标记技术在水稻 抗稻瘟病 遗传研究中得到广泛应用，加速了水稻 抗稻瘟病 基因的鉴定和定位。迄今，利用这些标记定位的 抗 稻瘟病 基因不下 60 个 (表 限制性片段长度多态性 (和同工酶标记是最早应用于水稻 抗稻瘟病 基因定位的分子标记。利用 记， （ 1991） 将来自于品种 5137和 3 个主效 抗稻瘟病 基因 t)、 t)和 t)分别定位于水稻的第 11、 6 和 12 染色体上，标记与目的基因的距离分别为 15.3 （ 1995） 将我国地方籼稻品种红脚占的一个主效 抗稻瘟 病 基因 t)定位于第 12 染色体上，距离 记 （ 1996） 将日本品种 主效抗病基因 位于第 2 染色体的末端，与 记 记 分离； （ 1994） 利用重组自交系群体 x 位了 2 个主效 抗稻瘟病 基因 t)和 t)，前者位于第 4 染色体上标记 间，后者位于第 11 染色体上标记 间。 （ 1996） 利用重组自交系 x 来自于 稻瘟病基因分别定位于第 6、2、 12 染色体上，将来自于 位于第 11 染色体上。 （ 2003） 利用 定位了 9 个抗稻瘟病基因，其中 5 个基因位于新的染色体位点。利用同功酶标记， 个抗稻瘟病基因，其中 t)和 t)位于第 6染色体， t)和 t)位于 第 2 染色体， t)位于第 11 染色体， t)位于 第 7 染色体 （ et 1996, 1998,1999a,1999b） 。 的 子标记 具有操作简单、花费少、稳定性高等优点，因而被广泛应用于基因的定位。朱立煌等 （ 1994） 利用 记定位了 1 个来自于窄叶青 8 号 抗稻瘟病 基因 位于水稻第 8 染色体，离 记 外，et 2003） 、 t) (et 1999) 和 t) (et 2002) 等 抗稻瘟病 基因也是通过 记定位的。李仕贵等 （ 2000） 和 （ 2006） 利用 合 分子标记的技术手段定位了 t)、 t)两个主效抗病基因。 （ 2000） 利用 合记将稻瘟病主效抗性基因 t)定位于水源 365 的第 11 染色体。 （ 2005） 、 （ 2005） 利用 标记技术将 抗稻瘟病 基因 t)和 t)分别精细定位于第 8 染色体上 17围内和第 1 染色体上 60围内。近年来， 2 万余个水稻 记已被开发和应用（ et 2002; 2005） ，大大推动水稻 抗稻瘟病 基因的精细定位和克隆。 基于基因组序列分析的单核苷酸多态性 (插入缺失多态性 ( 是近年来开发出来的新型分子标记，它们普遍存在于水稻基因组（ et 2004） ，特别适用于 抗稻瘟病 基因的精细定位和分子标记辅助选择。目前， 第一章 文献综述 3 （ et 2006） 等开发了针对 9个 抗稻瘟病 基因的特异性 记，为准确鉴别不同抗性基因和有效开展分子标记辅助育种提供了有力工具。 稻 抗稻瘟病 性 在对主效 抗稻瘟病 基因进行定位的同时，有关研究者也利用各类分子标记对一些持久或部分抗性品种进行了抗性数量性状位点 (析。 （ 1994） 利用 记在持久 抗稻瘟病 品种 定位了 10 个控制部分抗性的 们分布于 8 条染色体上 , 控制着病斑的大小、病斑数目和病叶面积，其 中 3 个抗性 于主效 抗稻瘟病 基因 （ 2004） 利用 记 在另一持久 抗稻瘟病 品种 检测到 5 个 抗稻瘟病 它们分别位于第 2、第 7、第 8 和第 10 染色体上，可以解释病斑叶面积 变异 。除多个抗性 ， 含有至少 3 主效基因 t)、 t)和t) （ 999） , 也 含有至少 3主效基因 t)、 t)和 t) （ et 2004） ，多个主效 抗稻瘟病 基因与多个抗性 共同存在，可能构成了这些品种持久 抗稻瘟病 性的分子基础。 2001） 利用 记 在 田间抗性品种 定位了4 个 抗稻瘟病 别位于 第 4、第 9、和第 12 染色体上，它们可以解 释 间抗性变异，并利用回交系 将 贡献率最大的 1 个 定位于第 4 染色体上，与 记 317 分别相距 第一个被定位的隐性 抗稻瘟病 基因位点。 2005） 将来自 部分抗性基因 t) 定位于第 11 号染色体 间，两标记仅有 遗传距离。 （ 2006） 将来自 部分抗性基因 t)定位于第 1 号染色体 间，两标记相距 遗传距离。 据统计，利用 位策略已经定位了 20 多个部分抗性基因或 于利用常规定位群体估计出的 信区间一般都在 上，难以确定它是一个效应较大的基因还是一个微效基因簇 （ et 2005） ，因而有必要对 行精细定位，在目标 域建立高分辨率的标记图谱，分析目标 这些标记间的连锁关系。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 4 表 目前已鉴定和定位的水稻稻瘟病主效抗性基因 of in 因 供 体 标记类型 考文献 l 1 Yu et 1991 5173 Yu et 1991 et ,1994 2 Yu et 1991 t) 同工酶 12 Yu et 1991 工酶 6 et 1996 t) et 1994 t) et 1995 t)(窄叶青 8 号 朱立煌等 , 1994 t) 1 et 1996 t) 工酶 6 et 1998 t) 工酶 2 et 1998 t) et 2003 t) 工酶 2 et 1998 t) 工酶 7 et 1999a t) 1 et 2000 t) 红脚占 2 et 1995 t) 2 et 1997 t) 中 156 12 et 1999t) et 2002 t) 1 et 2001 t) et 1999b t) et 2003 t) 0 et 2003 t) et 2003 t) 1 et 2003 t) 2 et 2003 t) 2 et 2003 t) et 2003 t) et 2005 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 5 续表 目前已鉴定和定位的水稻稻瘟病主效抗性基因 .1 of in 因 供 体 标记类型 考文献 t) et 2005 t) 1 et 2006 et 1996 2 号 经典遗传 11 et