【毕业学位论文】（Word原稿）转基因生物安全性评价的研究-生物测试

北京大学硕士学位论文 0 摘要 . 1 . 2 1. 前言 . 3 基因生物安全性评价的必要性及评价体系的建立现状 . 3 价 转 因抗虫棉对鱼类安全性的意义 . 4 鱼类安全 性的评价方法 . 7 关斑马鱼的研究 . 10 2 材料和方法 . 14 料 . 14 验动物 . 14 验用棉籽 . 14 试剂 . 14 器 . 15 方法 . 17 验处理 . 17 性毒性实验 . 18 性毒性实验 . 18 3 结果 . 20 性毒性实验 . 20 性毒性实验 . 20 官和组织的形态、结构 . 20 核试验 . 24 性对照物试验 . 24 式实验 . 24 细胞的测量 . 27 4. 讨论 . 28 性毒性试验 . 28 性水平的毒性试验 . 29 核试验 . 31 论 ： . 33 参考文献 . 34 附录 . 39 附录 . 40 附录 . 41 图版说明 . 42 北京大学硕士学位论文 1 摘要 以斑马鱼 (实验材料，从一般毒性（急性，慢性），遗传毒性两个层次评价转 因抗虫棉棉籽粉对鱼类的生物安全性。急性毒性试验结果显示转 因抗虫棉对斑马鱼无急性致死毒性，也没有急性非致死性毒性。慢性毒性试验的病理学检查表明，肝脏、脾脏和肠均未发现解剖观察水平和光镜水平的病变。采用斑马鱼外周血红细胞微核试验的遗传毒性方法，证明诱变剂氟化钠可以明显诱导斑马鱼外周血红细胞微核率升高，并确定了合适的阳性反应条件。运用改进的小型鱼采血方法和建立的斑马鱼微核试验检测方法，检测了转因抗虫 棉的细胞遗传毒性，结果表明转 因抗虫棉没有诱发斑马鱼红细胞微核的遗传毒性。实验结果表明在鱼类饲料中使用规范比例的转 因棉籽粉是安全的。 关键词：转 因抗虫棉、斑马鱼、安全性评价 北京大学硕士学位论文 2 he of t to is by of is as No of t to is of of No on on is is on of is to be a of to aF to in is of N is of of a of NT t N On of a is of t in is to t 京大学硕士学位论文 3 1. 前言 基因生物安全性评价的必要性及评价体系的建立现状 生物技术的逐渐成熟和不断提高生产力水平的要求促使越来越多的转基因生物出现，而随着转基因生物的商品化、生产规模化，转基因生物在地球上的分布范围也在不断扩大。从 1994 年 司推出的商品名为 转基因番茄被批准大 规模释放 1到 1996 年 6 月，美国已有 40 多种转基因作物进入中试阶段 2。 截止到 1998 年底，中国 已获得了 20 多个高抗 、 丰产 、 品质优的 转基因抗虫棉 花品系。现已有两个优系通过了品种审定，被命名为中国抗虫棉 1 号(中国抗虫棉 95 ( 转基因抗虫棉的播种示范面积已达 16 万亩，遍及河北、河南等十多个省、市、自治区 3。预计到 本世纪末，中国 的种植面积将要达到 500 万 公顷 以上。 面对越来越多的 转基因生物进入生态系统，人们不禁担心这些生物是否会给生态系统带来难以预料的灾害。在 历史上有 不少因盲目引入新的生物而造成生态系统失衡的教训，如将野兔引入澳大利亚，将杜鹃花引入英国等等 4。因此，在引入新物种的问题上，生态学家都很慎重。转基因生物对于生态系统来说虽不是新的物种，但是它把新的性状带进了自己的生境。对于这一生境里的其它生物来说，这个性状可能是完全陌生的，或者是以完全陌生的途径接触这个性状。实际上，转基因生物给环境里的其它生物带来新的环境压力，也对整个系统产生了新的压力。在这一点上，转基因生物和进入系统的新物种有着相似的作用。如果引进转基因生物的准备工作做得好，系统会保持平衡。如果考虑得 不充分、不周密，那些打破生态系统平衡的灾难还可能出现。 事实上，重组 术在七十年代一出现，它的安全性就受到人们的关注5， 6。以 首的一些从事重组 究的生物学家于 1975 年在 7，呼吁要对重组 术加以控制，并制定了一套安全防护的标准。这就是著名的 议，标志着人类对转基因生物安全性关注的正式开始。目前各国已不同程度地向环境中释放了多种转基因微生物、转基因植物和动物，一些基因工程产品也已商品化，安全性问题更引起人们的注意和争论 8。一些国家 制订了相应的法规，由特定的机构来管理转基因生物的试验和应用。美国在1986 年公布了生物技术法规协调大纲，任何转基因植物，只要其供体 、 受体北京大学硕士学位论文 4 或所用载体含有植物病原体片段，就要受到该法规的约束。欧共体也在 1990 年发布了有关转基因生物管理的指导，其中 90/219 针对封闭环境中的转基因生物的应用， 90/220 针对转基因生物有目的的环境释放。我国也越来越重视转基因生物环境释放的安全问题。原国家科学技术委员会于 1993 年 12 月发布了基因工程安全管理办法，要求转基因生物释放之前要进行安全性评价。农业部成立了农业生 物基因工程安全管理办公室和生物基因工程安全委员会，并实施 了农业生物基因工程安全管理办法 9。针对这种要求，许多研究开发转基因生物产品的实验室和公司都开始对他们所要推出的新的转基因生物进行安全性评价。美国的 司评价了他们研制的 转 因抗虫棉环境释放安全性以及对哺乳动物、鱼类、鸟类等非目标生物的影响，但所有数据均未公开发表。本实验室的丁志勇曾对转基因耐氨粪产碱菌 (1523 的释放做了较为系统的安全性评价，张宁评价了 转 因抗虫棉的棉籽粉和棉籽油 对小鼠的遗传毒性。 目前对转基因生物的安全性评价还没有形成一套完整、规范的体系。首先，评价所关心的受影响生物类群集中在哺乳动物，而对其它生物类群，诸如低等动物考虑很少。其次，评价的方法和指标不规范，没有一致的、可比较的、代表各种生物类群的模型生物，针对一种生物类群或一种生物所选择的评价指标也缺乏一致性和可靠性。本论文的目的是为转基因生物安全性评价建立适宜的模型鱼，同时建立对模型鱼的评价指标体系和方法。 价 转 因抗虫棉对鱼类安全性的意义 本论文所评价的转 因抗虫棉（以下简称 ）是由中国农 业科学院、山西省农业科学院棉花研究所、江苏省农业科学院研究，将 苏云金杆菌的 虫蛋白基因修饰、改造后，转入棉花 得到的。 苏云金杆菌 (产生大量的伴胞晶体，伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成，这种蛋白通常被称为杀虫结晶蛋白（ 昆虫中肠的碱性和还原性环境下，原毒素被降解成 60右的活性小肽并和中肠上皮微绒毛上的受体结合，结合于受体的蛋白随之插入到细胞膜上并 形成穿孔，使细胞膜周质和中膜腔之间的离子平衡被破坏，引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致瘫痪或死亡 10。通过质粒消除实验及结合转移实验证明大多数 其基因的克隆及结构分析表明： 端是其活性部位，最小活性片段在于 N 端 29607 位氨基酸残基上 11,12。根据 5 作物病虫害防治的需要，各国的科学家们开始试图将编码 造后转入需要保护的农作物中。我国对这一领域的研究非常重视，并取得了丰硕的成果。中国农业科学院生物技术中心以及江苏省农业 科学院经济作物研究所，根据不改变 虫蛋白的空间活性和选择植物偏爱密码子两条原则，对野生型 因进行了完全改造，全序列合成了 虫蛋白基因 虫基因与 ），得到了用于棉花转化的表达构建体 1） 13。 合成的杀虫基因通过花粉管通道法和农杆菌介导法转移到我国棉花主栽品种中，获得了20 多个高抗 、 丰产 、 品质优的转基因棉花品系。 表 1: 虫基因与 野生 )杀 虫基因比较 : t 野生 )杀虫基因 虫基因 蛋白 61508基 1845824变碱基数 0 329/1824( 修改密码子数 0 353/608( 边界序列； E：增强子； 35动子； ：序列； 聚腺苷酸； ：止子； 边界序列。 E: 35 : : : 图 1 粒简图 A of 京大学硕士学位论文 6 鱼类是水生生态系统特有的类群。在水生生态系 统中，它们是主要的消费者，占据着水生生态系统食物网的最上层。它们与水生植物和其它水生动物的种类、数量和分布有密切关系。它们的存在使得生产者 分解者这个循环得以良性发展，水生生态系统的物质循环和能量流动得以优化 14。另一方面，鱼类和人类有密切的关系。它们是人类优质的动物性食品来源、观赏对象、运动对象（垂钓）以及工业原料。它们的营养价值远高于其它动物性食品。鱼肉的蛋白质主要是肌凝蛋白和肌溶蛋白，这类肌肉肌纤维短，肌蛋白之间连接疏松，水分含量高，结缔组织的间质蛋白少，易被蛋白酶分解而被人体吸收。鱼肉的 生物利用率可高达 8590%。鱼肉中脂肪含量较低（一般在 3%以下），而且以不饱和脂肪酸为主，对防治心脑血管疾病有好处 15。由此可以看出，鱼类无论在经济上还是生态系统中都具有重要的地位。 中国的棉籽饼资源极为丰富，年产量约 400 万吨。棉籽去壳榨油后得到的棉籽饼，其粗蛋白含量高达 40%，而鱼类对棉籽饼中粗蛋白的消化率一般在 80%左右。棉籽饼属于棉籽油生产的副产品，价格低廉，使用棉籽饼作为鱼类饲料的蛋白源将会大大降低养殖成本，特别是降低一些中低档鱼类的养殖成本。因此，棉籽饼（棉粕）已成为一种普遍认可的水产饲料 的蛋白源 16。当 大范围地替代普通棉时，水产饲料组成势必会发生相应的改变。考虑到鱼类在自然界中的重要性和它与人类的密切关系，我们完全有必要对这种新型棉花及其棉产品对鱼类的影响做谨慎、全面的评价和预测。 美国的 司曾就其研制生产的 对鱼类、鸟类、哺乳类等非目标生物做过毒性检测，作出 对非目标生物无任何影响的结论。他们认为这些非目标生物的消化道组织没有 而，这些蛋白不能打乱消化，也不会产生毒性。 但他们的评价报告没有任何有关鱼类的毒理 学数据。龙繁新等曾做过苏云金杆菌以色列亚种（ 药制剂对鱼的急性毒理实验 17。在该实验中，草鱼、鳙鱼在含有苏云金杆菌菌液的水族箱中饲养了三天，各实验组和对照组的死亡率经统计分析无明显差异，但是该实验没有评价鱼类长期接触苏云金杆菌可能受到的影响。我国研制的 的外源基因是经过人工改造的全序列合成基因。如表 1 所示，无论是基因还是表达的杀虫蛋白与苏云金杆菌产生的天然 较大差别 13。除上述区别外，伴随着目标基因序列的 转入，一些 的来说， 相对于普通棉花所发生的性状改变是复杂的，已有的安全性评价还不充分。 北京大学硕士学位论文 7 鱼类安全性的评价方法 完整的安全性评价除对要评价的化学物质进行毒性试验外，还应结合预计受影响群体的流行病学调查，然后作出综合性评价 18。但由于 产品事实上还没有与鱼类接触，无法取得流行病学的可靠资料，前瞻性的评价只能依靠毒性实验。为了对受试化合物的毒性进行全面而深入的评价，毒理学家普遍认为毒理学试验的程序应该是灵活的。一般来说，一般毒性试验（急性、慢性） 和遗传毒理学试验都是首选的试验类型 19。 急性毒性试验 是在短期内大剂量或高浓度给予动物染毒的试验，可以在短期内对受检物的毒性有所了解，并对预防急性中毒提供科学资料。急性毒性试验可分为急性致死试验和急性非致死试验 18。急性致死试验的评价指标就是死亡，目 的是为了找到所要评价的化合物的致死剂量，一般有以下几种表达方法：绝对致死剂量 (半数致死剂量 (最小致死剂量 (最大耐受剂量 (详见附录 )。急性非致死试验的评价指标就是除死亡以外的其它毒性效应，这些效应可以是形态学的、解剖学的、组织学的，也可以是生理学、生物化学的。在实际试验中，可以选择其中的一种或多种指标。急性非致死试验要求测定急性毒作用域 (见附录 )。 慢性毒性试验 是指将试验动物长时间暴露于低剂量有毒物质，以评价该有毒物质对试验动物的影响。慢性毒性试验的目的是评价长期接触的一般毒 性，并确定最大无作用剂量和慢性作用阈剂量。病理毒理学是毒理学研究的一个分支，它从形态学的角度来研究外源性化学物质造成的生物机体的组织和细胞形态、结构改变，包括这种改变的发生、发展以及结局的规律，并以此作为依据来判断外源化学物质对动物的中毒模型，或机体产生形态改变的部位、性质、程度和特点。在我国和国外有关农药、食品、药品等安全性评价程序中，病理毒理检验均列为必须检验的项目之一 20。 有关鱼类的遗传毒理学最早是集中在畸型学观察方面，主要观察的是天然存在的致畸因素，例如辐射对鱼类胚胎发育的影响 21。后来 ，这方面的研究进入到试验阶段，研究者开始有意识地引入一些对鱼类遗传性状有影响的外界因素，先是辐射一类的物理作用，后来是化学物质 22。 次报道了鱼类染色体损伤 23。他的发现促使鱼类遗传毒理的研究进入到一个新的阶段，即揭示遗传毒性效应的微观基础。目前，遗传毒理学领域的飞速进展推动鱼类遗传毒理的研究方法取得了很大的进步。现在，这种研究已经建立起自己的一套方法系统，北京大学硕士学位论文 8 包括长期试验和短期试验两大类。 流行病学调查是一种长期试验方法。由于这种方法有很多局限性：耗时费力、对毒物的敏感性差、难 以区分是一种毒物还是多种毒物的作用、难以获得足够大的对照群体等，因此目前在遗传毒物检测上利用不多。 长期动物致癌性试验是另一种长期试验方法。 次应用小型鱼类做了致癌性试验。他的研究和后人的研究证实了小型鱼类作为诱癌剂检测材料的优点：对诱癌剂的高敏感性、肿瘤发展速度快、在实验室里可以大量饲养试验动物24。然而，这种试验需要的时间太长，至少需要半年以上。长期试验方法的检测速度远远落后于新化学物质研制产生的速度，不能满足要。因此，在鱼类遗传毒理研究中出现了各种短期试验方法。 短期的鱼类遗传毒理试 验直接检测化学物质对 影响。因为，不论宏观发生的病变是癌变、畸型还是遗传变异，最初变化都是发生在生物的基因组上。 第一类短期鱼类遗传毒理学试验是体外试验。较早地应用于这类试验的有鱼类的肝细胞和成纤维细胞。肝细胞功能上属于体外试验体系中的营养细胞 25，它自身不会受到遗传毒物损害，但可以活化间接细胞遗传毒物，促使其对靶细胞产生遗传毒性。成纤维细胞可以成为细胞遗传毒物的靶细胞。然而成纤维细胞遗传毒理学体外试验系统缺少代谢激活机制，不是一个完全的体外试验系统。到目前为止，还没有一个完全由鱼类的细胞组成的体 外试验系统 26。目前，有体外培养鱼类红细胞做微核试验 27和体外培养淋巴细胞用于 验 28的报道。 第二类短期鱼类遗传毒理试验是体内试验。在体内试验中，细胞遗传学的试验方法运用得较多，主要有以下三种。第一种是染色体畸变试验。由于大多数鱼类的染色体多而小，这种方法只局限用于少数鱼类。例如， 22 条大型的、形态区别明显的染色体。这种核型满足了 1980 年提出的作为染色体畸变试验的模型生物的基本要求 29。所以 少有的一种适合染色体畸变试验的试验鱼类。总体上 ，由于遗传毒理试验材料常是一些经济鱼类，而这些鱼类不一定有适合核型。所以近十年来，鱼类染色体畸变试验用得并不广泛。 较之染色体畸变试验，第二种试验方法， 姊妹染色单体交换试验（ 检测灵敏性明显要高。 试验证明，诱发 率显著升高的剂量远小于导致染色体畸变的剂量 30。另外， 结果与检测物质的诱变性和致癌性有很好的相关性 31。目前，除了继续优化体内 验的操作程序外，还开展了 外检测方法的研究。 中取出淋巴细胞进行组织培养，然后将培养的细胞暴露于 ，这样他们观察到淋巴细胞 平的明显升北京大学硕士学位论文 9 高 28。当然， 要依靠染色体的形态来判断试验结果，依然受鱼类核型的限制，不能用于大多数鱼类。 第三种细胞遗传学方法，微核试验 (近年来极为活跃的一种遗传毒理学试验方法，它不具有上述两种方法的局限。微核是细胞分裂过程中遗留在子细胞体的染色单体片段，因为这种细胞内一个或 多个染色质小体远小于主核（ 故称为微核（ 微核产生的原因有两个：染色体断裂和纺锤体功能障碍 32。由于微核试验操作过程简单、迅速，而且微核试验与染色体分析（当检查体内相同的体细胞时）的灵敏度基本一致，对相同受检物定性反应相同，出现阳性反应的最低浓度也基本一致。因此在小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验建立以来的二十年中，微核试验技术发展很快。当前，微核试验的发展主要在以下几个方面： 一是受试细胞类群选择，已经从小鼠骨髓嗜多染红细胞扩展到许多种其它细胞类型 。诸如动物的胃粘膜细胞、肠细胞、精子，植物的蚕豆根尖细胞 33，人的口腔上皮细胞、毛囊细胞 34，以及鱼类 35， 36， 37， 38和两栖类 39的外周血红细胞。 二是血涂片的制备方法，采用了自动制片、微核细胞提纯等方法。常规小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的一个缺陷是其它有核细胞和颗粒的干扰，观察者很难将这类假微核细胞完全排除，并因此造成计数上的误差。 用 去有核细胞和颗粒，只保留嗜多染红细胞和正红细胞，提高了微核试验的准确性 40。在体外微核试验中，收获细 胞要在低渗条件下进行。但细胞经化学物质处理后，对低渗的耐受性发生变化，使低渗不易掌握。顾祖维等用离心制片机制片，取消低渗这一步骤，提高了体外微核试验的成功率34。另外只有计数分裂过一次的细胞的微核才能准确反映染色体的损伤。为了将只分裂过一次的细胞与其它类型的微核细胞区分开， 用细胞松弛素 B 阻断细胞质分裂，只计数双核细胞中的微核，除去了其它类型微核细胞的干扰，从而提高检出微核率的可靠性 34。 三是微核计数方法上的改进。显微镜下人工计数微核，既耗时又难于控制主观因素的影响。用仪器 代替人来完成这一任务是必然的趋势。目前有两种尝试：一种是用流式细胞计测定红细胞的微核。该方法是将细胞核与细胞质分别染色。然后用 式细胞计测定这两种染色的峰值，最后用计算机比较这两种峰值的数据，得到微核细胞的比率。显然，该法仅适用于检测无主核细胞中的微核41。第二种是用图象分析仪鉴别微核。该方法是先将微核细胞和无核细胞的图象输入计算机，通过编程，建立这两种细胞的标准模式。然后将涂片扫描，数据输入计算机，由计算机将扫描图象与标准图象比较，判断细胞的类型。虽然从理北京大学硕士学位论文 10 论上说，这种方法也可以检测有核细胞的 微核，但是图形分析复杂，而且误差较大，还难以实际应用 40。 四是微核试验的新检验标准。微核有两种成因，但微核试验不能将遗传毒物诱发的微核与非遗传毒物引起的微核区别开。目前，为了区分上述两种成因的微核，许多新的方法被引进了微核试验。这些方法的原理就是非遗传性毒物诱导的微核是由整条染色体构成的，而遗传毒物诱导的微核只是染色体片段。有三种判断的方法被采用，一是被 液深染的物质的微核的百分率。完整的染色体含有着丝粒，着丝粒能够被 液深染。非遗传性毒物诱导的微核是整条染色体，在这种微核中可 以观察到被 液深染的着丝粒异染色质。而遗传毒物诱导的微核无此特点。因此可以通过统计带有被 液深染的物质的微核百分率来判断微核的主要来源，即诱发的原因。二是微核的面积。因为由遗传毒物诱发的微核只是染色体片段，而非遗传性毒物诱发的微核是整条染色体。经统计分析，遗传毒物诱发的微核的面积只有非遗传性毒物诱发的微核面积的一半。故可以通过对微核面积的计算来判断微核的主要来源。三是微核的 核涂片经 色，用图象细胞计测定微核中 含量。以细胞中最小的染色体的 量为 阈值。非遗传性毒物诱发的微核是整条染色体，其 量会大于或等于阈值。而遗传性毒物诱导的微核是染色体片段，其量小于阈值 42。 关斑马鱼的研究 斑马鱼 (英文名 生活在南亚次大陆的河流中，现在已成为一种在世界各地都很常见的观赏鱼类。斑马鱼最大可以长到 寸，雄鱼要比雌鱼体色鲜艳 43。这种小型鱼类对一般的鱼病有较强的抗性，而且对养殖水体硬度，温度，酸碱度的变化有较大的耐受性。但是当水温的变化超过24 4 C 时，胚胎的畸形率明 显升高 44。 行的研究，阐明了产卵量、胚胎死亡率、幼鱼孵化成功率以及繁殖频率之间的关系，大大促进了斑马鱼繁殖方法的改进，有助于满足一般生物学实验所要求的实验样本整齐一致的条件 45。斑马鱼的发育速度很快，在 27 C 的条件下，只需 60 小时就可以孵化出仔鱼 46， 100 天就可以达到性成熟。雌鱼的产卵间期只需要十五天 47。这样快的生长、繁殖速度允许实验室能够在较短的时间内获得大量的实验材料，提高试验效率。 尽管斑马鱼受到生物学界的普遍重视只有不到十年的时间，但它已是生物科学许多 分支的重要试验动物，对这些学科的发展起着重要作用，如：发育生物学、北京大学硕士学位论文 11 繁殖生物学、畸型学、神经生物学、环境科学和行为学研究。 在上述学科中，畸型学研究者进行了最早和最基础的研究。 938 年详细观察了斑马鱼的正常受精卵的发育过程，报告了受精卵内物质重排，结构重建的过程，记录了受精卵直径、粘度和表面张力的细微变化 48。而 研究在 1958 年对斑马鱼的胚胎发生第一次做了全面的描述，他们提供了斑马鱼胚胎发育的时间表 49。这个时间表在以后的三十年里一直是发育生物 学、畸型学、生殖毒理学的研究和试验设计的标准。直到 1995 年，定了一个更细致、更完美的时间表 50。当今的畸型学研究积极利用新技术，从手工绘图、笔记描述试验结果的时代进入到利用扫描电子显微镜、共聚焦显微镜精确记录和展现试验结果的时代 50， 51。 在畸型学和发育生物学领域，目前的研究成果有以下三个方面：一是致畸机理的研究，将胚胎发育划分成几个阶段，确定不同阶段对致畸剂的敏感性 52，并将这一研究成果应用于毒理学和药理学研究 53。二是将斑马鱼的胚胎当作一个试管，在其中尝试 用各种化学物质来调控胚胎发育，力图用斑马鱼的人为缺陷来模拟某些人类的天生缺陷。例如： 发现细胞间信号因子的超正常表达会导致斑马鱼和人类相似的先天性眼病，这一研究成果将 1971 年和 1966 年的有关这种先天性眼病的研究联系了起来，并有望在近期内将这一研究成果用于临床治疗 54， 55， 56。第三是对再生现象的研究。例如对鳍再生现象的研究已发展到了对控制鳍再生基因的克隆和进行序列分析 57。 斑马鱼生殖生物学的开创实质上是以畸型学和胚胎学的需要为研究中心，目的是完善人工受精技 术来创造大批处于同一发育阶段的胚胎和提高斑马鱼的受精率和孵化率 。在寻求促使发育一致的方法方面，尽管科学家们已经为之努力了二十多年，但仍然没有找到满意的答案 50。在增加繁殖成功率方面，七十年代末的研究结果已科学阐明：增加雌鱼繁殖间期的时间，采用雄鱼刺激雌鱼的方法可以明显提高繁殖成功率，而水质的情况和雄鱼的数量却出人意料地不具有显著的影响 58。从那之后，斑马鱼繁殖生物学自身的发展就趋于停滞，繁殖生物学家把注意力放在将已有的研究成果用于其它一些经济鱼类的养殖实践，或是将繁殖生物学的基本知识和正常繁 殖的一些基础数据用于环境科学，使用一些与生殖有关的基本数据来评价污染物对鱼类的影响 59。 在斑马鱼行为研究领域， 的研究代表着最新的进展和行为科学的主要发展趋势。他们对控制斑马鱼接触刺激反应，逃逸反应的基因进行了分析，目的是揭示一些神经生理反应的遗传学机制 60。这是一个跨学科研究的典范。 至于斑马鱼在遗传学和神经生物学上的研究进展，最近十年称得上是日新月北京大学硕士学位论文 12 异。这不仅表现在文献数目多，而且表现在经常被高水平的学术刊物录用，具体发展参见 0的综述。 斑马鱼 在环境科学领域的应用进展是我们最关心的内容。在这个领域，科学家最初用斑马鱼来研究一个生物学中的传统问题，即相对于生物的遗传背景，环境因子究竟能在多大程度上影响生物 61。例如， 将温度、盐度、光照以及溶解氧的浓度等作为测试因子，来研究环境因素对斑马鱼表型的影响。研究的结果表明，如果将受精卵的上述发育条件改变，那么，仔鱼的脊椎数目也会随之改变；如果将亲鱼的繁殖条件改变，只是在温度升高的情况下，仔鱼的脊椎数目才会增加 62。从六十年代中后期以后，对环境因素的研究逐渐被对一些人为因素（主要是化学污 染物）的研究所替代，这是当时发达国家严重的污染问题和人们对污染问题开始重视的结果。 1967 年用斑马鱼的鱼苗来测试 种对哺乳动物低毒的杀真菌农药）的急性毒性。该研究显示，在 1暴露浓度下， 98%的受试鱼在90 分钟内死亡，并且可以根据试验结果画出一个暴露剂量 借该图可以检测出毫克级的 3。因为当时还没有 鱼类有毒性的报道，所以这一研究被认为是斑马鱼对毒物高敏感性的强有力的证据。根据 目前可查的资料，该急性毒性试验是第一次用斑马鱼来做此类研究。这篇论文以其周密的试验设计至今还常被一些有关斑马鱼急性毒性研究的论文所引用 64， 65。目前，斑马鱼的急性毒性试验方法已经非常成熟，得到广泛应用。斑马鱼被 可为化学物质急性毒性检测的 标准水生生物材料 65， 66。目前，急性毒性检测已不再是斑马鱼毒理学研究的重点，而化学物质的生态毒理学研 究日益受到重视。在这种研究中，斑马鱼作为淡水鱼类的代表来检测化学物质对鱼类的急性毒性和这种化学物质在鱼体中的富集、转化、残留 65， 67。另外，毒物动力学 64， 68， 69（研究毒物在体内迁移、转化、功能等的一般机理的科学）、生殖毒理学 70都是斑马鱼毒理学常涉及的方面。生殖毒理学研究中大量使用斑马鱼的原因主要是目前有关斑马鱼胚胎发育的研究成果比较多。根据许多有关斑马鱼的毒理学研究成果，研究者一致认为利用斑马鱼作为水生毒理学生物活体测定材料 (以下几点优势：可以一次获得大量受精卵， 一般的成熟雌鱼可以产卵 150 粒以上，最多可达到 300 粒；胚胎在整个发育期透明，易于进行胚胎操作；发育迅速；仔鱼成活率高，容易得到大量品质一致的鱼做毒理学分组试验