【毕业学位论文】（Word原稿）盐酸克伦特罗在动物组织中的残留分布及代谢规律动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 盐酸克伦特罗在动物组织中 的残留分布及代谢规律 in I 摘要 本文系统研究了盐酸克伦特罗（ 猪尿液、血液和组织中的残留分布及代谢规律。并通过放射性同位素 3H 标记试验，研究了 小白鼠体内的残留分布及代谢规律，进一步验证 猪体内残留分布及代谢规律。初步建立了猪眼睛中 高效液相色谱（ 测方法。 本实验选用 24 头健康育肥猪（ 平均 70右，公母各半），随机分成两组， 分别饲喂粮（ 5mg/ 10mg/连续 30 天。在用药的第 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 14、 20和 29 天，每剂量组任选 3 头，采集尿样和血液样品； 10mg/量组于用药的第 2、 4、 6、10、 14 天分早（ 8 009 00）、中（ 12 001 00）、晚（ 5 006 00）三点，每点随机采集 6 份尿样；在停药的第 0、 3、 7、 14 天每剂量组任选 3 头猪屠宰，采集尿液、血液、眼睛、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和肌肉（三角肌、第 13 腰椎肌、股二头肌）样品。采用高效液相色谱法测定样品中的药物残留。检测结 果显示： 服吸收很快，饲喂第 1 天即可从尿液中检出，用药期有两个残留高峰分别是 饲喂 第 3 天和第 20 天，残留浓度 随用药剂量增加升 高 ；同一天不同时间点尿液中 留不同，中午、傍晚尿液中 留 浓度 显著高于早上尿液中的残留 浓度 ，中午和傍晚尿液中残留差异不显著，但中午有高于傍晚的趋势。 猪 饲 喂 第 1 天即可从血液中检出 药期血液中 留 浓度 总体 呈上升趋势，尿液中 残留浓度 随用药剂量增加而升高 。 停药 0 天， 尿液、血液、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏和肌肉（三部分）中残留分别为 338.6 ng/g、 54 ng/g、 243 ng/g、 514.7 ng/g、 116.8 ng/g、 66.5 ng/g、 13.8 ng/g、 11.5 ng/g、 12.1 ng/g（ 5mg/量组）， 1417ng/g、 104 ng/g、 352 ng/g、 825.7 ng/g、 183.8 ng/g、 135.2 ng/g、 19.4 ng/g、 18.7 ng/g、 18.1 ng/g（ 10 mg/量组）。 不同组织中 谢 速度不 同 ，除肌肉停药第 7 天不可检出 外 （低于检测限 g），其 它 组织停药 14 天仍 可检出，残留浓度分别为 15.1 ng/g、 1.2 ng/g、 16.1 ng/g、 17.1 ng/g、 4 ng/g、 4.6 ng/g（ 5mg/量组）， 21.8 ng/g、 5.5 ng/g、 41.2 ng/g、 39.6 ng/g、 9.6 ng/g、 8.3 ng/g（ 10mg/量组）。研究表明： 在猪体 内残留，分布广泛且 代谢较为缓慢，不同组织代谢 速率不同。 另外， 本文还对 3H 标记的 小白鼠体内的残留分布及代谢 规律进行了研究，试验结果表明： 小白鼠体内分布广泛，在所取的 13 种样品中，均有 残留，不同的组织残留 浓度不同，代谢速度也不相同。与对猪进行的实验相比，基本一致。在小鼠实验中毛发残留较高， 代谢 最慢， 而且药物在毛发中存在稳定， 所以 是检测 常理想的靶器官（组织）。 小白鼠是色素缺乏性动物，但在眼睛中 留仍然较高， 代 谢较慢，仅次于毛发， 所以眼睛也 是检测 为 理想的靶器官（组织）。 最后， 初步建立了猪眼睛中 效液相色谱 （ 检测方法，制作了标准曲线，线性范围为 0g/法的检测限为 g，定量限为 5ng/g，回收率为70%110%，变异系数 用该方法检测猪眼睛中 留结果如下： 停药 0天， 猪 眼睛中 留浓度远远高于其它 组织，两剂量组 留浓度 分别高达 1716.1 ng/g 和 2981.5 ng/g。 谢 较为缓慢，停药第 14天两剂量组残留 浓度 仍高达 107.2 ng/g 和 385.2 ng/g。由此可知， 眼睛中 具有 高残留、慢消除 的 特点， 进而表明 眼睛是 测 为理想 的 靶器官（组织）。 通过以上研究表明， 在动物体内残留蓄积，分布广泛，且代谢较慢，不同组织（器官） 中 代谢速率不同。毛发是检测 留 非 常理想 的靶器官（组织），眼睛、肝脏和肺脏在一定程度上可以代替尿液作为检测 靶器官（组织）。 关键词： 盐酸克伦特罗 猪 小白鼠 高效液相色谱 残留 代谢 规律 n we of in 3HCL in a L in to 0 mg/L 0 23468101420th 9th of we in at 4610th 4th 0mg/kg , 37th 4th of We of B/T to L in CL be in at of L rd 0th in L 0mg/kg mg/kg L in at in in in CL be in at of L 0th 9th in L 0mg/kg mg/kg L in 38.6 ng/g, 54 ng/g, 243 ng/g, 514.7 ng/g, 116.8 ng/g, 66.5 ng/g, 13.8 ng/g, 11.5 ng/g 2.1 ng/g (5mg/ 1417ng/g, 104 ng/g, 352 ng/g, 825.7 ng/g, 183.8 ng/g, 135.2 ng/g, 19.4 ng/g, 18.7 ng/g 8.1 ng/g (10 mg/ of in 4 L be in g)， L in 5.1 ng/g, 1.2 ng/g, 16.1 ng/g, 17.1 ng/g, 4 ng/g .6 ng/g (5mg/ 21.8 ng/g, 5.5 ng/g, 41.2 ng/g, 39.6 ng/g, 9.6 ng/g .3 ng/g (10mg/ of L L in of in we to L. We 3HCL in in 3HCL in is in L in is of is so it be a L， to a or be a to L. A L by V of of g; of ng/g; 0% of L in 1716.1 ng/g (5mg/kg)981.5 ng/g (10mg/kg) 07.2 ng/g (5mg/kg)85.2 ng/g (10mg/kg)4 is a to L. we to L in is as is a to L， to a or be as a of to L. V 目 录 第一章 序言 . 1 酸克伦特罗的理化特性 . 1 酸克伦特罗的药理及毒理 作用 . 2 酸克伦特罗的药理作用 . 2 伦特罗的毒理作用 . 3 酸克伦特罗引发的中毒事件 . 4 酸克伦特罗的作用效果 . 4 酸克伦特罗引起的中毒事件 . 4 国对盐酸克伦特罗的禁用情况 . 5 酸克伦特罗在机体内的残留分布及代谢规律 . 7 酸克伦特罗在动物体内的药代动力学研究 . 7 酸克伦特罗在动物体内的代谢规律 . 8 酸克伦特罗在动物体内的残留分布及代谢规律 . 10 酸克伦特罗在动物体内总残留分布及代谢规律 . 14 . 14 酸克伦特罗的检测方法 . 15 联免疫分析方法（ . 15 效液相色谱法（ . 16 相色谱 ） . 16 试验研究目的意义 . 17 究目的 . 17 究意义 . 17 第二章 盐酸克伦特罗在猪尿液、血液及组织中的残留分布 . 18 料与方法 . 18 验材料 . 18 验方法 . 19 果与讨论 . 22 尿液中盐酸克伦特罗残留、代谢规律 . 22 血清中盐酸克伦特罗残留、代谢规律 . 24 不同组织中盐酸克伦特罗残留分布、代谢规律 . 25 眼睛中盐酸克伦特罗残留、代谢规律 . 32 尿液、血清及组织中盐酸克伦特罗残留比较 . 33 期存放后各组织中盐酸克伦特罗残留变化 . 35 结 . 35 三章 3H 盐酸克伦特罗在小鼠血液及组织中的残留分布 . 37 . 37 验材料 . 37 验方法 . 38 果与讨论 . 39 白鼠组织中盐酸克伦特罗总残留分布、代谢规律（见表 3 . 39 白鼠血液中盐酸克伦特罗总残留的代谢规律 . 43 白鼠眼睛中盐酸克伦特罗总残留的代谢规律 . 45 白鼠毛发中盐酸克伦特罗总残留的代谢规律 . 45 白鼠体内盐酸克伦特罗总残留的雌雄差异 . 46 结 . 48 第四章 猪眼睛中盐酸克伦特罗 测方法的研究 . 49 . 49 品与试剂 . 49 要仪器设备 . 50 验方法 . 50 要溶液配制 . 50 谱条件 . 51 准曲线制备 . 51 睛样品的前处理 . 51 收率和精密度测定 . 51 果与分析 . 52 谱条件 . 52 准曲线 . 53 法的检测限和定量限 . 53 收率及精密度 . 54 论 . 54 种前处理的比较 . 54 取液、萃取液选择 . 56 化 . 57 . 57 结论 . 58 参考文献 . 59 致谢 . 66 作者简历 . 67 略词表 英文缩写 英文全称 中文名称 酸克伦特罗 效液相色谱仪 相色谱质谱联用仪 免疫分析 据分析系统 测限 量限 of 异系数 重 磷酸腺苷 相萃取 二胺四乙酸二钠 肾上腺素受体 ,高残留限量 根过氧化物酶 国食品药品管理局 o 作用剂量 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 1 第一章 序言 饲料是动物食品，动物产品又是人的食品，所以 说饲料安全 即食品安全。近年来饲料安全引发了一系列事件，受到世界各国的关注 。 “疯牛病”致使英国、加拿大等国损失惨重，“二恶英”造成比利时畜牧业一蹶不振，最终导致内阁下台，“瘦肉精”引发的中毒事件，曾一度引起世界人民 的恐慌，有害色素催生红心蛋，氯霉素残留虾，孔雀石绿污染水产品 等事件，均表明 饲料安全已成为一个非常重要的问题， 并 引起了世界各国政府的高度重视。 目前，在我国影响饲料及畜产品安全的主要因素 即是违禁药物的违法使用 ，“瘦肉精”是其 中非常有代表性的一种，在我国 曾 引发了一系列的 畜产品 安全问题 ， 我国政府对此高度重视， 为此 组织了专项整治工作，以确保饲料及畜产品安全。“瘦肉精”即盐酸克伦特罗（ ，是肾上腺素受体激动剂类药物（简称激动剂）的一种。该 药物最初用于治疗呼吸系统疾病，由于能有效促进蛋白质合成和肌肉组织生长，减少脂肪尤其是皮下脂肪的沉积，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率和饲料转化率 （ 1984） ， 曾一度在畜牧业中应用； 但 在动物体内蓄积，人食用 含 有该药物 残留 的动物产品后会引发中毒现象 。因此 许多 国家相继禁止了 畜牧业中的使用，我国政府也出台 了一系列相关 法律法规和文件，禁止 激动剂在动物生产中使用； 但是受经济利益驱使，一些不法商贩仍然在饲料中违法使用，这对我国 的畜产品安全和 人民的健康造成了严重威胁。 据不完全统计， 1998 年以来，我国相继发生因食用含有 猪肉及其制品而导致的群众集体中毒事件 17 起，中毒达 1500 余人，死亡 1 人。 毒事件的 发生，引起了我国政府的高度重视，旋即组织了一些列拉网式、扫荡式检查，取得了显著成绩。 2005 年上半年，由国家饲料质量监督检验中心（北京）牵头组织的 全国统检中，养殖场生猪尿样中以“瘦肉精”为代表的违禁药品检出率为 但各地区检出率不平衡，广东东莞市“瘦肉精”的检出率高达 目前我国检测 靶器官 是尿液，但是受季节、时间的影响尿液存在诸多不稳定因素，影响检测结果 。由此可见控制 法使用尚有许多有待提高之处，因此有必要 系统 的 研究违禁药物在动物体内残留 分布 及代谢规律，寻找 更稳定、 更 合理的检测靶器官（组织），制定有效的检测方法，切实保证饲料及畜产品安全，保障人民健康和生命安全。 酸克伦特罗的理化特性 盐酸克伦特罗（ 是一种人工合成的肾上腺素受体激动剂类药物， 1964 年首次合成，为选择性很强的受体激动剂。 名双氯醇胺、氨哮素、克喘素、氨必妥、克难必太罗、喘舒膜、氨双氯喘通、氨双氯喘等（徐友宣， 2002），俗称“瘦肉精”。分子式为 -（叔丁氨基） 甲基 3， 5 1分子量为 该化合物常温下为白色或类白的结晶性粉末、无臭、味微苦，在水或乙醇中溶解，在三氯甲烷或丙酮中微溶，在 乙醚中不容，可由天然儿茶酚胺衍生合成，熔点在 172176，熔融同时分解（中华人民共和国药典， 2005）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 2 图 1酸克伦特罗化学结构 图 1激动剂的共同特征 -1 -2 AR 激动剂类药物具有共同的化学结构（图 1 如图所示， 该类药物 有 三个活性基团组成：芳香环、羟基和脂肪氨基，这三种集团形成的特异性结构构成了肾上腺素受体（ 结合位点，在苯环的邻位、对位和脂肪氨基末端的 R 位上可有不同取代（见表 1这样构成了不同的激动剂类药物（ 1998）。根据苯环上取代基的差异，可以将激动剂分为苯胺型和苯酚型，其中苯酚型又可分为邻苯二酚型、间苯二酚型和水杨醇型。 由于该类药物化学 结构中含有 1 或 2 个手性碳，故其 分子具有旋光性，盐酸克伦特罗属于苯胺型药物，商品 1 1 的消旋体，其中只有左旋体有效（李俊锁， 2002），而临 床上大多数激动剂都是左旋异构体。 表 1激动剂的取代特征 he AR 香环取代 类型 R 位取代 A B C H H 酚 叔丁基集团 H 苯二酚 异丙基集团 H 儿茶酚 烷基苯基 H 水杨醇 烷基苯酚 酸克伦特罗的药理及毒理 作用 酸克伦特罗的药理作用 肾上腺素受体（ （现发现三种亚型 1 受体、 2 受体、 3 受体）普遍存在于哺乳动物的细胞表 面（ 1993， 1998）。 与组织细胞膜上的 合，通过鸟苷酸结合蛋白（ G 蛋白）途径激活腺苷酸环化酶，催化三磷酸腺苷（ 化为环磷酸腺苷（ 蛋白激酶活化，诱发一系列酶的磷酸化过程，进而发挥其生理效应。 对呼吸系统作用。可以引起气管、支气管平滑肌松弛，作用强而持久，还可以增加中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 3 呼吸道纤毛运动促进痰液排出（方炳虎， 1997），因此最早应用在治疗呼吸系统疾病上。 对生殖系统的作用。对子宫 平滑肌有强烈的舒张作用，可以治疗牛、马晚产、流产等疾病，也用在人身上，降低子宫收缩，避免造成胎儿流产（ 1993）。 对泌尿系统的作用。松弛尿道平滑肌，可以有效治疗前列腺切除术后引起的轻度至重度压力性尿失禁（ 1997）。 对骨骼肌 的 作用。 抑制肌肉萎缩的作用，据 道可以提高矫形病人的相对肌肉力量，因此认为对肌肉废用性萎缩有潜在的治疗作用。 营养再分配作用。 受体结合后可以引起肌肉中环磷酸腺苷和乳酸浓度的快速升高，肌糖元浓 度下降 ，加快肌肉蛋白质的合成速度，长期 使用能增加肌肉体积、增加体重（ 1989）。 可以使蛋白激酶活化，活化的蛋白激酶可以灭活乙酰辅酶 提高激素敏感酯酶和甘油三酯分解酶的活性，这种变化一方面促进脂肪的分解，另一方面减少脂肪的合成（王若军， 1994）。 够提高胴体瘦肉率，促进生长，因此有“瘦肉精”之“美称”。 对神经组织的作用。 保护海马神经组织对抗氨基酸 种神经保护可使它成为一种治疗缺血性卒中很有潜力的药物（郭颂， 2000）。 此外对大鼠研究发现还能诱导生长因子 化星形胶质细胞，对脑组织的缺血损伤有保护作用（ 1999）。 伦特罗的毒理 作用 具有一定药理作用，但易在动物体内蓄积，一次性摄入量过大时会 对人和动物 产生 一系列的毒副作用。 对骨骼肌的影响。 骨骼肌表面的受体结合，可以引起骨骼肌收缩增加，能够破坏快缩肌纤维与慢缩肌纤维间的融合现象，引发肌肉震颤，四肢和面部最明显，轻者感觉不适，重者出现行走不稳、无法握物（李俊锁， 2002）。 对心血管系统的影响。 受体结合（ 1994），可导致体内聚胺浓度 升高而继发心脏肥大，造成心率过速，血压升高，严重时出现心肌梗死。 血管壁弹性降低，引起血压升高，微循环血管膨胀，压迫刺激周围的神经，引起头痛头晕（张清安， 2005） 。 还可以激活 K+ 进入细胞内引起血钾降低，造成低血钾症，进而导致心律失常（ 2001）。 可降低血液中抑制肌肉兴奋性的 度，间接促进肌肉兴奋（凌明亮， 2003） 。 此外还可 引起人内脏横纹肌和平滑肌兴奋性增强，表现为 呕吐和腹泻症状。 对生殖系统的影响。 巢和子宫内膜显著扩张，子宫雌激素受体和孕激素受体显著增加，病理切片上可以看到卵巢卵泡闭锁 性萎缩、功能性黄体的完全缺失、子宫内膜腺体数量的减少等，表明 1999）。 对生化指标的影响。 可以增加肌糖元的分解，引起血乳酸、丙酮酸升高，并出现酮体，易引起糖尿病人代谢紊乱，导致酮症酸中毒和乳酸中毒；可以影响肝细胞中的胰岛素样中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 4 生长因 I（ 的产生（郑元林， 2002），引起胰岛素水平变化，研究结果不一（ 周光宏，1991； 1993）。 此外 发性脂肪酸和葡萄糖流量产生影响（郑元林， 2002） 。 对肾上腺功能的影响。 过度刺激肾上腺分泌（ 1998），影响肾上腺的正常功能。 对免疫系统的影响。 以抑制 免疫系统 产生抗生长激素释放抑制因子（ 抗体，从而 对 机体 免疫产生影响 ， 这可能就是其具有促生长作用的原因 （ 1996） 。 酸克伦特罗引发的中毒事件 酸克伦特罗的作用效果 964年由美国氰胺公司首次合成，最初 是作为一种治疗呼吸道疾病和痉挛的药物应用在人和动物身上。上世纪 80年代初，美国一家公司发现 用量高于治疗剂量 510倍 时 ， 可明显促进动物生长、改善胴体品质、提高瘦肉率， 欧美等国 曾 将1995） 。八十年代后期，我国部分大专院校和科研机构将该药物作为开发项目，向饲料企业和养殖户推广。由于 15%，骨骼肌脂肪降低 8% 15%（张清安， 2005），所以养殖户和饲料企业争相使用。 吴子林 （ 1996）研究发现， 28、 2、 1mg/结果显示， 3mg/mg/ 3个 剂量组肉鸭的皮及皮下脂肪分别比对照组减少 3个 剂量组肉鸭的 腹脂分别比对照组降低了 刘清等（ 2002）报道猪饲喂 3mg/8天，猪背最长肌面积增加 19%，背膘厚下降 23%，胴体明显瘦于对照组。可见 此在一些 国家 曾 得到了广泛的使用。 酸克伦特罗引起的 中毒事件 有促进生长和提高动物瘦肉率的作用，但是易在动物体内残留蓄积，因此上市前要经过一段时间的停药期，然而一些养殖场往往不经过停药期就直接上市，这造成了 动物组织中的大量蓄积，引发了一系列的中毒事件： 1989年 10月 1990年 7月，西班牙 135人因食用残留有 肝中 60ng/g 291ng/g（ 1990；杨诗兴， 2001）。 1990年 9月 24日，法国南部赖昂司毒物 研究中心发现一家 4口表现出肌肉颤抖、头痛、心动过速等 期赖昂司兽医毒物研究中心也发现在 个地区共有 8家 22人表现出 因是食用残留有 991）。 1991年 3 6月间，西班牙发生两起集体中毒事件，共有 43家人中毒，原因是食用了残留中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 5 有 1991）。 1991年 12月，西班牙 59人因食用 调制的饭后水果中毒（ 1992a、 b） 。 1992年，西班牙 113人因食用残留有 992a、 b）。 1996年，意大利 62人食用残留有 1998）。 我国也引发了一系列的中毒事件（见表 1这仅仅是粗略的统计，实际中 此可见， 危害性，随着中毒事件的发生，各国相继禁止了 动物生产中使用。 表 1酸克伦特罗在我国引发的中毒事件 L 时间 地点 中毒人数 1998 年 5 月 香港 17 1998 年 5 月 广东省高明市 7 1999 年 9 月 浙江省嘉兴 57 2000 年 8 月 上海市 37 2001 年 1 月 9 日 浙江省海宁市 40 2001 年 4 月 上海市 40 2001 年 1 月 11 日 浙江省余杭市 63 2001 年 8 月 14 日 浙江省湖州市 10 2001 年 8 月 22 日 广东省信宜市 51 2001 年 8 月 23 日 浙江省桐庐市 120 2001 年 11 月 7 日 广东省河源市 484 2002 年 3 月 13 日 江苏省苏州市 26 2002 年 9 月 17 日 上海市 62 2003 年 3 月 14 日 广东省顺德市 397 2003 年 10 月 18 日 辽宁省辽阳市 86 国对盐酸克伦特罗的禁用情况 在动物中蓄积，且较难消除，人食用 含有 留的动物产品后会 引起中毒，因此早在 1988 年，美国食品与药品管理局（ 将肉品中的盐酸克伦特罗作为 肉品的 必检项目，并于 1989 年建立了 残留检测方法。 欧盟也很快作出了反应：规定自 1988 年 1 月 1 日起严禁在饲料中添加 盐酸克伦特罗及同类产品。 我国政府对肾上腺素激动剂类药物的非法使用也非常重视，制定并下发了一系列相关的法律法规及文件，禁止在动物生产中使用盐酸克伦特罗等激动剂类药物，确保人民的健康安全。相关的法律法规及文件如下： 1997 年 3 月 25 日，我国农业部发布了关于严禁非法使用兽药的通知（农牧发【 1997】3 号）。严禁将肾上腺激动剂等药物作为动物促生长剂使用。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 6 1997 年 9 月 4 日，农业部发布动物性食品中兽药最高残留限量（农牧发【 1997】 7号）。规定在马和牛的肌肉、肝脏、肾脏及牛奶中的最高残留 限量（ 别为 允许摄取量（ 0 d)。 1998 年 6 月 19 日，对外贸易经济合作部、农业部、国家出入境检验检疫局联合发布文件关于严禁非法使用兽药和加强检疫工作等有关事项的通知（【 1998】外经贸管发第 382号）。通知要求各级畜牧部门按照有关规定，加强兽药管理，严禁制售未经农业部批准的兽药及动物促生长剂，严禁在饲料及饲料添加剂中非法使 用兽药，同时也要