【毕业学位论文】（Word原稿）过量表达细菌的FolC和FolP基因对提高拟南芥叶酸含量的研究生物化学与分子生物学博士论文

I 密级 论文编号： 中国农业科学院 博士研究生学位论文 过量表达细菌的 因对提高 拟南芥叶酸含量的研究 of of of of 文摘要 作为供给人体叶酸需求的主要来源之一，植物中的主要作物如水稻、小麦和玉米的叶酸含量很低。对植物 叶酸合成途径调控机理的研究，目前仅对 化脱羧酶（ 较深入的研究。本文拟对植物叶酸生物合成途径中的另外 2 个酶即二氢叶酸合成酶 /多谷氨酰胺叶酸合成酶（ 及二氢喋呤合成酶（ 行研究，探讨它们在植物（拟南芥）叶酸生物合成中的作用。在植物中 别由不同的基因编码，而在 则由 因同时编码； 由 因编码，在植物中则由类似的基因编码。将来源于 因分别与酵母 因的线粒体定 位序列连接，并由 5S 启动子驱动。取得了以下主要研究结果： 1. 系统地分析了来源于 因的作用：（ 1） 析表明，来源于 因在拟南芥植株中得到了表达。（ 2）对 基因纯系 11 幼苗植株和幼嫩叶片的叶酸含量分析表明，这 3 个纯系幼苗植株的叶酸含量分别为 g 鲜重，而对照为 g 鲜重；这 3 个纯系其 幼嫩叶片的 叶酸含量分别是 g 鲜重，对照为 g 鲜重。因此无论是幼苗植株还是 幼嫩叶片，转基因纯系的叶酸含量均显著高于对照。（ 3） 达高的纯系 叶酸含量也高，而 达较 的纯系 其叶酸含量也相应低，因此 基因纯系的叶酸含量与 因的 达量呈正相关。（ 4）对转基因纯系其内源 码基因的 达的定量分析结果表明，外源 因在幼嫩叶片中的过量 表达，并没有促进内源 码基因的表达。 因此外源 因在拟南芥植株中的过量表达，提高了植株的叶酸含量，而且转基因植株叶酸含量的提高是由于外源 因而非内源 码基因作用的结果。 2 分析了拟南芥野生型植株内源 码基因的表达以及植株不同发育时期叶片的叶酸含量。 析表明：内源不同的 码基因其 达水平不同，幼嫩叶片中 表达量最高；此外， 嫩叶片中最高， 具有组织特异性。叶酸的测定结果表明，不同发育时期叶片的叶酸含量不同。结合内源 码基因的表达分析以及对 叶酸含量的分析，结果显示：野生型植株的叶酸含量与内源 码基因的 达量呈正相关。 3 基因植株比野生型植株开花明显提前，但对植株的生长发育没有负面影响，相反 11 单株结荚数和单株干重还明显高于对照植株。 4 析表明， 来源于 因在拟南芥植株中得到了表达。对 基系株系的叶酸测定结果显示，独立株系 苗其叶酸含量分别是 g 鲜重 ，而野生型对照 为 g 鲜重 ，转基因株系的叶酸含量均显著高于对照 。 上所述，本文首次研究了 编码基因对提高拟南芥叶酸合成的作用，获得以下创新性结果： 来源于 因在拟南芥植株中过量表达，提高了拟南芥植株的叶酸含量，而且证明了转基因植株中叶酸含量的提高，是外源 因 而非内源 码基因作用的结果。 阐明了植物（拟南芥）的叶酸含量与叶酸生物合成途径中 的编码基因的 此，叶酸生物合成途径中的 对植物（拟南芥）叶酸的合成起调控作用，而且可以在 平上起调控作用。 来源于 因在拟南芥植株中的过量表达，提高了拟南芥植株的叶酸含量，因此，植物叶酸生物合成途径中的 对叶酸的合成起调控作用。 对拟南芥植株内源 码基因的 达分析表明：它们的表达具有组织特异性。 关键词 : 拟南芥； 叶酸； 生物合成；代谢工程 文摘要 de on of as in of is is of of of of (. of is to of . to by 5S, as 1. of on 1） 2） on In of 41112of in of of of in (3) 41211a It 4） of in of it of 2. of of V of on in It of in In At of is In in in of in it in to of 3. of 1112of 4. of in 26, in in In a It of of to in It of of of be be in of in of of of of of in 录 论文评阅人和答辩委员会 . 错误 !未定义书签。 独 创 性 声 明 . 错误 !未定义书签。 中文摘要 . 文摘要 . 一章 文献综述 . 1 物代谢工程研究进展 . 1 酸研究进展 . 1 酸的化学结构与生理功能 . 1 酸与人体健康 . 4 叶酸 . 5 酸的添加、强化以及人工叶酸的副作用 . 9 物叶酸的生物合成 . 10 酸的测定方 法 . 15 活性及代谢中间化合物的测定 . 16 物叶酸代谢工程研究进展 . 17 酸研究进展小 结 . 18 . 19 研究的立题依据、研究目的、意义和技术路线 . 20 第二章 材料与方法 . 22 因的分离、载体的构建和农杆菌转化 . 22 体、引物设计及实验试剂 . 22 因及酵母 . 23 色体 . 23 . 23 E 激感受态细胞的制备 . 24 连体系 /质粒转化 . 25 . 25 . 25 . 26 其检测 . 28 . 28 于 析的样品 . 28 于分析叶酸含量的样品 . 28 南芥的转化 . 29 基因植株的筛选 . 30 . 30 1独立转化植株及纯系的筛选 . 30 2代植株卡那霉素抗性比例分析 . 30 基因植株的 . 30 析 . 32 南芥总 . 32 . 33 . 34 子杂交 . 35 析 . 36 酸含量分析 . 37 酸的提取 . 37 酸的酶解 . 37 . 37 酸标样的准备 . 38 酸含量的测定 . 39 的表型分析 . 39 第三章 植物表达载体的构建 . 40 . 40 表达载体 . 42 . 42 . 44 . 45 第四章 转基因植株的筛选 . 46 . 46 . 46 . 46 性 遗传分析 . 47 转 因植株分析 . 47 转 因植株分析 . 47 基因纯系的筛选 . 49 获得 4个独 立的 . 49 转 因纯系的筛选 . 50 结 . 54 第五章 转基因植株 因表 达检测及其叶酸含量测定 . 55 析 . 55 . 55 结 . 56 第六章 拟南芥野生植株内源 因表达分析及叶酸含量测定 . 57 源 因的表达分析 . 57 同基因的表达差异分析 . 57 同组织 . 62 . 62 结 . 63 第七章 基因植株分析 . 64 析 . 64 量分析 . 64 . 64 表达分析 . 65 . 70 . 70 . 70 基因植株的表型分析 . 72 结 . 75 第八章 结论与讨论 . 76 研究创新点 . 78 参考文献 . 79 附录 . 92 致谢 . 103 作者简历 . 104 中国 农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 随着人们生活水平的不断提高，饮食对人体健康的影响日益受到重视，通过食物补充和调节人体微量营养元素的平衡，以增强免疫、延缓衰老、有益于基础代谢、促进生长与发育等，已成为 21 世纪人类的第一追求。因此植物次生代谢物已成为人类植物育种的重要目标之一。叶酸与人体的多种疾病有关，是目前植物代谢工程的重要研究课题。 物代谢工程研究进展 植物次生代谢物在植物的整个生命周期中具有多种功能，如调节植物与环境的关系（ 2001、 2001）、构成植物防御系统的一部分（ 2001）、吸引传媒体协助传粉以提高雄性育性、决定食物食味、颜色、气味、观赏植物和花卉的颜色等。随着植物中的一些生物活性物质的生化代谢途径被阐明，通过对 代谢途径进行修饰和改造，从植物中获得目标代谢产物的大量积累；或者合成新的生化物质、抑制有害物质（如过敏原）的产生等，显示了植物代谢工程巨大的潜力。在 过去 10 多年里，一些参 与次生代谢反应的酶基因已被成功地在植物中过量表达， 通过改造化合物的生物合成途径 , 提高了目标化合物的合成，或者提高了过量表达的酶的直接产物 。表 生代谢物含量的一些成功例子 ，研究主要集中在类黄酮、维生素 E、维生素 A（类胡萝卜素）、维生素 C、胆碱、氰化葡萄糖等方面，以及关于叶酸方面的最近成果。 然而由于植物细胞代谢网络错综复杂，植物次生代谢途径中所知的基因甚少，对代谢网络的关系及其调控还缺乏认识，因此，目前还不能从已有的研究结果总结出一般的规律，未来几年植物代谢工程研究的重点将转 移至对代谢途径进行深入研究，在基因、酶、及化合物的分布、化合物的转运和积累研究方面获取更多的信息，为代谢工程采取成功的策略奠定理论基础。 酸研究进展 叶酸又称维生素 为辅酶参与生物体内碳 植物和微生物不同，人体不能合成叶酸，必需从食物中摄取。目前世界范围内人体缺乏最严重的维生素之一就是叶酸，并已导致严重的健康问题，如新生儿神经系统疾病、癌症及心血管病等。因此通过改良作物提高叶酸的含量已引起人们极大的兴趣。 酸的化学结构与生理功能 天然叶酸（四氢叶酸）的基本结构 由喋啶环、苯基甲酸（ 谷氨酰胺三部分组成，在喋啶环 1基团，处于不同的氧化态； 氨酰胺通过 位中国 农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 置连接谷氨酰胺（图 (2002) 。植物种类不同，其细胞中叶酸的谷氨酰胺数目有 311个不等 (2000)。 植物以及所有其它生物细胞内碳 互转化及供给等反应均需要叶酸的参与。哺乳动物和植物的碳 1994； 1999）（图 在植物中，叶酸还参加甘氨酸氧化生成丝氨酸的反应，因而被认为与光合作用有关（ 1999）。 I 化合物名称 酶或基因 结 果 参考文献 类黄酮 矮牵牛查尔酮异构酶 ( 番茄果皮类黄酮含量提高 78 倍 2001 玉米转录因子 1 番茄果肉类黄酮含量提高 21 倍 2002 类胡萝卜素 水仙八氢番茄红素合成基因、细菌 水稻种子胚乳合成 000 细菌番茄红素 素含量达到 2mg/重 八氢番茄红素脱氢酶基因 水仙八氢番茄红素合成酶基因和 大麻 0 倍 999 细菌八氢番茄红素脱氢酶基因 细菌八氢番茄红素合成酶基因 番茄果实类胡萝卜素总含量降低 2000 50%, 4 倍 细菌番茄红素 番茄果实 倍 2000 维生素 E 拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶 ( 拟南芥种子中维生 素 E 总含量 2003 提高 1015 倍，玉米提高 6 倍 拟南芥 拟南芥种子 998 的含量由原来的 10%提高到 90% 拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶 拟南芥种子维生素 E 总含量提高 2 倍 2002 异构酶和酚脱氢酶 烟草叶片维生素 E 总含量提高 3 倍 2001 老鼠酪氨酸氨基转移酶 烟草叶片和拟南芥叶片 2001 维生素 E 总含量提高 4 倍 维生素 C 二氢抗坏血酸还原酶 烟草和玉米维生素 C 含量提高 2 003 老鼠 烟草和莴苣叶片维生素 C 含量提高 4 000 胆碱 磷酸乙醇胺 磷酸胆碱提高 5 倍 , 胆碱提高 50 倍 水杨酸 细菌异构酚合成酶和丙酮酸裂解酶 拟南芥质体水杨酸提高 20 倍 , 001 细胞质水杨酸提高 23 倍 氰化葡萄糖 高粱细胞色素 ， 拟南芥合成了 氰化葡萄糖 999; 萄糖转移酶 001 叶酸 化脱羧酶 ( 拟南芥叶片叶酸含量提高 2004 人的 化脱羧酶 ( 番茄果实叶酸含量提高 2 倍 2004 表 通过代谢工程提高植物代谢化合物的含量 of 国 农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 图 酸的化学结构 of 1of as in a of up to is to , B (of of 图 乳动物中叶酸的代谢和功能 in 中国 农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 酸与人体健康 在过去的 30年里 , 越来越多的证据表明叶酸对人类健康具有重要作用。人体维持正常的代谢、细胞分裂、神经功能以及生长都需要充足的叶酸。人体缺乏叶酸 与贫血、神经系统疾病、心血管病及癌症等发病率增加有关。 血 叶酸缺乏导致的最常见的病症是贫血，如引起孕妇红细胞低而导致贫血，或使缺铁性贫血加重。目前全世界有 20亿即相当于三分之一的人口患有不同程度的贫血，其中 90%发生在发展中国家。在我国边远农村， 50%的 5岁以下儿童以及 41%的孕妇患有贫血症，一般人群贫血病患者的 23%缺乏叶酸，而孕妇及少年儿童贫血病患者高达四分之三的人群缺乏叶酸（ 2004）。 叶酸缺乏导致贫血的机理尚不清楚，由于叶酸在 酸 缺乏会导致 常的细胞分裂不能维持，尤其是快速分裂的细胞如骨髓细胞，结果细胞分裂周期延长 , 生红细胞成熟延迟，生成异常的红细胞前体 些幼巨红细胞粗放地进行分化，而那些成熟的细胞常被骨髓巨噬细胞吞噬或降解，引起红细胞不足并最终导致贫血（ 2000； 1978）。 经系统疾病（ 新生儿缺陷是造成婴儿死亡最主要的原因， 死亡率高达 22%，而存活的婴儿中有 34%存在出生缺陷。在中国死胎和死生的四分之一至三分之一是由 而在中国北方农村高达 对动物的研究、流行病学调查以及干扰实验证明，叶酸对神经疾病有预防作用。叶酸能够预防 70年代开始，人们就怀疑人体缺乏叶酸会导致 直到 80年代中期和 90年代初，才从干涉实验中获得有力的证据。从 1981年至 1992年间发表的 9篇研究报告中的 8篇表明，孕妇在怀孕的全过程补充叶酸， 070%（ 2000； 1995； 1992； 2001）。 1999年美国疾病与预防中心报道，在中国的南方和北方两个地区进行的试验发现，妇女从婚前检查开始至怀孕的最后三个月之前，每天补充 400微克的叶酸，胎儿或新生儿 ( 1999)。 大量的研究表明，提高血清或红细胞的叶酸浓度， 血清中同型半胱氨酸的浓度与叶酸浓度成反比，因此新生儿缺陷包括 由于低浓度叶酸或高浓度同型半胱氨酸引起，或者二者兼之（ 2000； 2000； 1999； 1995） 。神经管道及其他正在发育的器官对叶酸或同型半胱氨酸