【毕业学位论文】（Word原稿）鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 鸭肠炎病毒部分基因结构 及相关功能的初步研究 请 学 位 类 别 ： 农学博士 专 业 ： 预防兽医学 研 究 方 向 ： 动物病毒分子生物学 及分子免疫学 培 养 单 位 ： 中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使 用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究 论文作者 李慧昕 指导教师 孔宪刚 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评 阅 人 刘文周 教授 博士生导师 东北农业大学 预防兽医 王笑梅 研究员 博士生导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 刘湘涛 研究员 博士生导师 兰州兽医研究所 预防兽医 答辩 主席 崔玉东 教授 博士生导师 黑龙江八一农垦大学 生物技术 答 辩 委 员 崔玉东 教授 博士生导师 黑龙江八一农垦大 学 生物技术 王君伟 教授 博士生导师 东北农业大学 预防兽医 步志高 研究员 博士生导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 李景鹏 教授 博士生导师 东北农业大学 基因工程 仇华吉 研究员 博士生导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 吴东来 研究员 博士生导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 相文华 研究员 博士生导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 答辩时间与地址 2007哈尔滨兽医研究所学术报告厅 记录人员 刘春国 I 摘 要 鸭病毒性肠炎（ 又名鸭瘟（ 是由鸭肠炎病毒（ 起的鸭、鹅及多种雁形目 禽类 的一种急性、热性、败血性传染病 ，曾在多个国家和地区发生流行，给 养鸭业造成巨大的经济损失 。 疱疹病毒科成员，第八次病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒。由于 子生物学研究相对滞后，其基因组组成和结构未知，在很大程度上限制了 病机制及该病在防控方面的研究。 本研究根据本实验室提交至 的 分基因组序列，选择在疱疹病毒中 较为保守的囊膜蛋白 要衣壳蛋白 及在绝大多数疱疹病毒成员基因组排列中保守的基因簇（ 行测序。选取同源性较高的 用 件对 5 个基因进行序列比对，分析各个基因编码蛋白的保守区。结果表明， 守， 之， 有胸苷激酶特征性结构域： 合结构域和核苷结合结构域。与 似， 存在 5 个保守位点。 码的蛋白 具有跨膜糖蛋白典型特征， 有 7 个糖基化位点， 6 个跨膜区，在 N 末端 121 位氨基酸为信号肽序列，符合疱疹病毒 蛋白的特点； 9 个潜在的糖基化位点， 3 个跨膜区，符合疱疹病毒 蛋白的特点。此外，根据 5 个基因编码氨基酸序列进行系统发育进化分析，发现马立克病毒属亲缘关系较近，但又形成独立分支。根据这 5 个基因比较结果，建议将鸭肠炎病毒归类为疱疹病毒科、 为了鉴定 时表达 用 间接免疫荧光方法检测 6 个重组蛋白的单因子血清与 病毒的反应性。结果表明 段蛋白制备的抗血清均能够与全病毒发生特异性反应，在大约 150检测到特异性蛋白条带，大小与 件预测的 白大小一致，说明 病毒 的结构蛋白，大小约为 150合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，初步认为 能是病毒的衣壳蛋白。应用 法检测 能够在 检测到预期大小的蛋白条带，但是，应用间接免疫荧光方法检测， 血清能够与全病毒发生抗原抗体反应，说明 病毒的组成成分，结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，以及 有跨膜糖蛋白特征，推测 能是病毒的囊膜糖蛋白 。应用 白抗血清检测 病毒，在大约 88检测到特异性蛋白条带，与 件预测 合其他研究报道，初步认为 病毒的结构蛋白。 应用 件对上述检测抗原性较好的 白从蛋白的亲水性、抗原性 以及 表面可及性进行表位预测，三段蛋白均存在抗原表位优势区，因此 选取 蛋白 制备单克隆抗体 ，拟对 原表位进行初步定位。将 白作为抗原免疫 6龄的c 小鼠，制备单克隆抗体，经过 3 次克隆，分别采用间接 间接免疫 光方法筛选，最后得到 4株（ 1346定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将 成两段进行表达， N 端命名为 C 端命名为 者有 16 个氨基酸的重叠。 测， 4 株单克隆抗体均能够识别 白，而不能够与 生特异性反应，说明获得的 4 株单克隆抗体都是针对 白的，即在 白 C 端 9211162 位氨基酸的片段内有能够被 4 株单克隆抗体识别的 抗原 表位。 关键词 鸭肠炎病毒 系统发育进化分析 K 构与功能 抗原表位 as is an is by in is a of of to as of EV to of on of of to EV we of as of as to of K of TP is In at 20 on EV a of We EV be To EV L6 in to to to of EV a of 50of of we as a EV as be be by We EV We be EV in of L6 EV a a IV 8We L6 as a EV of by so we to EV as to we 1346to in we 211162 EV be V 目 录 第一章 绪论 1 病毒性肠炎概述 1 肠炎病毒生物学特性 1 肠炎病毒特性 1 肠炎病毒形态发生 2 肠炎病毒分子生物学研究进展 3 病毒性肠炎诊断方法研究进展 4 合分析流行病学、临床症状和病理变化 4 毒的分离和鉴定 4 清学方法 4 子生物学方法 6 病毒性肠炎的防制 7 活苗 7 毒疫苗 7 疗 8 疹病毒分类及基因组结构 8 疹病毒分类 8 疹病毒形态结构 8 疹病毒基因组结构 9 疹病毒基因及其表达调节 10 疹病毒主要结构蛋白 11 细胞抗原表位的筛选 13 原表位概述 13 细胞抗原表位的研究方法 13 究的目的和意义 15 第二章 鸭肠炎病毒 部分基因 系统发育进化分析 16 料与方法 16 毒与细胞 16 粒与菌种 16 类及主要生化试剂 16 要仪器 16 增引物 16 胚成纤维细胞的制备 17 肠炎病毒的增殖 18 肠炎病毒滴度的测定 18 肠炎病毒基因组 取及 增 18 因的分子特征及系统发育进化分析 18 结果 19 肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上的 胞病变及蚀斑形态 20 EV 其侧翼序列及 增 22 EV 因的分子特征 22 肠炎病毒系统发育进化分析 29 讨论 35 肠炎病毒增殖 35 肠炎病毒部分基因的分子特征 36 肠炎病毒系统发育进化分析 38 第三章 鸭肠炎病毒部分 功能 基因的鉴定 40 料与方法 40 毒与细胞 40 粒与菌种 40 类及主要生化 试剂 40 要仪器 40 增引物 40 胚成纤维细胞的制备 41 鸭肠炎病毒的增殖 41 肠炎病毒基因组 取及 增 41 EV K、 组表达质粒的构建 41 EV K、 达及纯化 42 血清的制备 43 测 43 接免疫荧光检测 43 EV 为诊断抗原的初步应用 44 结果 44 增 44 组质粒 鉴定 45 组表达质粒的鉴定 47 组蛋白的表达及纯化 49 EV 定 50 EV 间接免疫荧光鉴定 52 EV 测疑似鸭病毒性肠炎血清样品 53 论 53 达载体的选择 53 EV 表达 54 EV 纯化和复性 55 EV 鉴定 55 EV 测鸭病毒性肠炎 58 第四章 鸭肠炎病毒 原表位的初步定位 59 料与方法 59 毒与细胞 59 粒与菌种 59 类及主要生化试剂 59 验动物 59 扩增引物 59 要仪器 60 物免疫 60 接 测方法的建立 60 胞融合 61 性杂交瘤细胞的筛选 62 交瘤细胞的克隆化 62 胞冻存及复苏 62 克隆抗体腹水的制备 62 交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定 63 EV 原表位的初步 定位 64 果 65 原的制备 65 选方法的建立 65 物免疫与抗