【毕业学位论文】（Word原稿）地衣芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表达微生物学硕士论文

密级 ： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 地衣芽孢杆菌来源 克隆、改造及其表达 F I 摘 要 被广泛应用到酿酒和饲料工业中。 国内对天然菌株的产酶量及酶的性能满足不了实际应用。然 而，分子生物学、基因工 程方法的应用为其提供了契机。 现在 国内外对 本研究的主要目的就是通过基因工程及分子生物学方法来提高 善其酶学特性 ，为目前生产中的问题提供有效的解决途径。主要研究内容及相应结果如下： 1. 天然菌株产酶研究 在基础产酶研究的基础上对培养基碳氮源及发酵条件进行优化。结果表明， 4复合碳源燕麦粉、麸皮等比单一成分葡萄糖、蔗糖效果好， 1天然氮源蛋白胨同样优于无机、有机氮源。利用优化的营养成分组成 培养基， 150 的情况下天然菌株发酵 48 h 得到最高的产酶量。 2. 表达 以 B. 因组 模板扩增获得了编码 它克隆到表达载体 )，然后转化 E. 重组菌经 导表达的重组酶 N 末端带有 6 个 签，分子量达 28达量占总蛋白的 占细胞 可溶性蛋白的 重组酶活力分别为 1286(1%大麦 和 986(1地衣多糖为底物 )U 活分别为 2479(1%大麦 和 1906(1地衣多糖为底物 )U 利用子亲和层析柱纯化目的蛋白 ， 重组酶最适 温度分别为 40 。 3. 表达 对以 B. 因组 模板进行 增获得的编码 因进行密码子优化改造，共改变 102个碱基， 量从 降到 将优化基因 ，重组载体 酶切线性化后电转化 P. 过筛选得到阳性重组子。重组 酶 在 P. 实现了分泌表达，摇瓶水平上 %大麦 和 地衣多糖为底物 ) U 未进行优化的 (4U 高了约 15 倍； 7L 发酵罐水平上蛋白分泌量达 250 活力达到 %大麦 和 地衣多糖为底物 ) U 活为 %大麦 和 地衣多糖为底物 ) U 最高产酶水平比未优化基因高 50 多 倍。 重组酶由于发生糖基化作用分子量高达 34总分泌蛋白的 最适 最适反应温度分别为 45； 酶有激活作用， 对酶有抑制作用；且重组酶表现了严格的底物特异性，作用于大麦 物对乳酸菌等益生菌的生长有显著促进作用。 根据 泳和酶的功能性分析证明，优化的重组蛋白已在 P. 实现表达，且 热稳定性有所提高。 关键词： 地衣芽孢杆菌， 斯德毕赤酵母，基因改造 , 表达 as an in is in of of a to At in or on of is to of it be an in 635) in as 1. of on - . of of it % as as % is 150 48 h. 2. is CR of NA . it 48 ), is . W of is 8 at of is of of in in ,286 86 U %(w/v) %(w/v) ,479 ,906 U is of .6 0 , 3. is CR of NA . In a 02 +C is is is . is on is . At 7.9 %(w/v)%(w/v)as it is by 5 U L is 50 33.7 %(w/v)%(w/v)as ,334.8 , is 0 W of is 4 it is of of .0 5 of as . 录 第一章 引言 . 1 . 1 . 1 . 1 . 2 . 4 . 4 原核表达系统 统 . 6 统概述 . 6 体 . 6 主菌 . 7 巴斯德毕赤酵母 写 P. 达系统 . 7 巴斯德毕赤酵母表达系统的优 势特点 . 7 表达载体 . 8 翻译后修饰及加工 . 11 P. 酵条件研究 . 12 P. 酵策略研究 . 13 外源基因自身 的改造方法 . 14 存在问题及实验方案 . 15 本研究目的及意义 . 17 第二章 天然菌株 地衣芽孢杆菌 酶研究 . 18 材料 . 18 方法 . 18 产酶培养基的优化 . 18 发酵条件的优化 . 18 酶活测定 . 19 果与分析 . 19 不同碳氮源的影响 . 19 发酵条件的优化 . 20 讨论 . 21 第三章 原核表达：地衣芽孢杆菌 源 34. 表达 . 22 料 . 22 法 . 24 重组载体的构建 . 24 重组大肠杆菌的构建 . 27 重组酶的诱导表达与 . 28 V 重组酶的纯化 . 28 重组酶的酶学性质 . 29 果与分析 . 29 . 29 . 30 重组表达载体的构建 . 33 重组酶的 . 36 重组酶的纯化 . 36 重组酶 的 酶学性质 . 37 论 . 40 达水平研究 . 40 达系统研究 . 40 学性质研究 . 41 第四章 真核表达： . . 42 料 . 42 法 . 43 B. 源 . 43 重组载体的构建 . 44 重组酵母的构建 . 45 重组酵母的产酶发酵 . 46 发酵参数的检测 . 47 重组酶的酶学性质 . 48 酶解产物分析 . 48 结果与分析 . 49 密码子优化 . 49 重组表达载体的构建及验证 . 50 重组酵母的构建 . 52 重组酵母的产酶发酵 . 53 重组酶的酶学性质 . 58 讨论 . 62 密码子优化 . 62 表达载体、宿主菌株的优化选择 . 63 重组酵母发酵罐水平上的条件优化 . 63 P. 密度发酵的优势 . 64 基因重组与表达策略研究 . 64 提高表达产物稳定性的研究 . 66 第五章 结论与展望 . 67 参考文献 . 69 致谢 . 75 作者简历 . 76 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 富含在大麦、 黑麦、高粱、稻和小麦等作物的胚乳细胞壁中，不同物种其含量、比例也不相同（表 1早期研究认为大麦 键；但越来越多的试验证明，大麦 键，且 键和 键的分布不是随机的。不同来源 键和 键所占的比例也不尽相同，其中 键占 25%30%。 表 1 in 源 g 麦粒比例 大麦 33 麦 5 黑麦 12 麦 7 为水溶性和水不溶性两种。水溶性 与蛋白质结合的 中 键的含量和糖的聚合度是影响水溶性的主要因素。 浓度愈高 ， 粘度愈大。高浓度 够吸收其周围的水分子 ， 从而降低周围环境的物理 特性。 在溶液中极易与带正电荷的物质结合。此外 ， 、钠等金属离子以及有机质。 制造麦芽汁过程中，由于大量高分子 使麦芽汁粘度增大，过滤困难；在发酵过程中过量的 酵母早期沉淀。在动物饲养中，存在于饲料中的 粘性、高亲水性、高吸水活性及吸附性等）影响营养物质在动物体内的代谢，从而降低动物对营养物质的吸收效率。 在于植物和微生物中，人和动物体内是缺乏的。目前，在杆菌 (, et 2005)、 梭菌 (, et 1991)、纤维菌 ( N, et 2005)、真菌 ( A, et 2002)、高等植物 ( J, et 2001)中都发现了 表1。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 表 1 源菌株 分子量 （ 文献 M. S, 1997 et 2005 J Y, 2003 文平等 . 2004 M, et 2005 宇等 . 2004 T, et 2005 , et 2003 卫芬等 . 2004 L, et 2001 N, et 2005 A, et 2002 构特征 200 多个 键和 键按 1:比例连接而成的链状高分子化合物。将大麦中分离出的水溶性 凝胶过滤层析和甲基化方法确定结构发现，近 90%的多糖是由 键所分隔的纤维三糖和纤维四糖单元组成， 5连续的 糖苷键相连的寡糖单元也占有较高的比例 （ 1997） 。 来源于杆状细菌的 6 家族，均具有一个相似的氨基酸序列，含保守序列 中的两个谷氨酸残基具有水解催化能力）。 非芽孢杆菌属来源 它们还经常带有一个附加区，如 源 09 个氨基酸的功能区，其中包含一个 30 个苏氨酸序列。 通过 研究来源 B. B. 交获得的 它同样属于糖苷水解酶 16 家族，也得到了 第一 个 芽孢杆菌产 是反向平行 折叠体系 (图 1蛋白核心通过两个 折叠互相堆积形成一个三明治结构，由七个反平行链组成，每条链是弯曲的，朝外的一面构 成一个凹穴，便于基质的结合。 折叠环大部分是由 转角建立的稳定结构，只发现一个具有 螺旋的转角。主环表面覆盖了部分由 折叠形成的基质结合区， 间的二硫键将主环和蛋白核心形成的 折叠连接起来。在分子凸面远离活性位点处是钙离子结合区域，起到稳定蛋白结构的作用 （ 2000） 。 分子的凹面区域认为是底物结合位点，可被外围的芳香族残基和底部的酸式残基线性化，催化残基位于具有严格极性和非极性链转换的 折叠上，该链的第一个催化残基朝向蛋白表面，能够与基质相互作用，其后的则朝向疏水的内部 （ A. C, 1995） 。这种结构类型在 16中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3