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文档简介
RNA提取操作流程1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30孵育10分钟后,于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为:A260 稀释倍数 40 ?g/ml。具体计算如下:RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495?l的TE中,测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ?l,剩余RNA总量为:35 ?l 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。2)变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60,10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS,pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 ?l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3?gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10?g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品cDNA合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶MMLV 0.5l6 DEPC水 5l7 RNA模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先7
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