细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术PPT课件

细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术 元英进天津大学2009 08 12 昆明 84年天津大学 学士 87硕士 91博士 93年副教授 95年教授 96年任博导 97年教育部跨世纪优秀人才99年人事部 百千万人才工程 第一 二层次 00年 至今历任化工学院副院长 院长 02年天津市 131 人才工程第一层次 03年天津市特聘教授 04年国家杰出青年基金获得者 天津市授衔专家07年国家教学名师 生物制药与现代中药工程 元英进 报告内容 紫杉醇的药源问题蛋白质组研究代谢组研究合成生物学研究 概述 1958 美国NCI开始筛选新型抗肿瘤药物研究计划 美国化学家Wani和Wall于1971年从太平洋红豆杉树皮中提取到一种抗肿瘤物质紫杉醇 紫杉醇的发现 与 微管蛋白N端第31位 217 231位氨基酸结合 抑制微管解聚 抑制有丝分裂 阻滞细胞周期于G2 M期 使癌细胞死亡 紫杉醇作用机理 概述 1979年 概述 1992年FDA批准紫杉醇2006年FDA批准多烯紫杉醇 晚期乳腺癌 晚期非小细胞肺癌晚期卵巢癌 胰腺癌 头颈癌胃癌 前列腺癌 概述 紫杉醇与多烯紫杉醇 H CH3 3CO 紫杉醇原料来源 1 天然红豆杉植物提取法 概述 2 化学全合成 2 Nicoloau路线 会聚式A环和C环 八元B环 得到ABC三环化合物 3 Danishefsky路线 会聚式D环 与A和C D环片段连接 合成八元B环 Holton路线 线性途径A AB ABC 3 半合成紫杉醇 侧链 化学合成 2R 3S 3 N 苯甲酰基 苯基异丝氨酸 避免了合成紫杉醇复杂的母环部分 母核 红豆杉针叶中提取巴卡亭III R Ac 或10 去乙酰基巴卡亭III 10 DAB R H 红豆杉细胞培养 2004年6月28日 Bristol MyersSquibb获总统绿色化学挑战奖 4 生物工程方法 概述 细胞生长与紫杉醇合成 关系 非偶联高产措施 诱导子 稀土铈离子 真菌多糖 甲基茉莉酸培养策略 前体饲喂 两相培养等 红豆杉细胞培养生产紫杉醇是很有潜力的技术 需要解析微观生物过程 形态变化 细胞分化与紫杉醇生产细胞应答机理 活性氧迸发刺激紫杉醇合成 同时引起细胞凋亡 微环境剪切力场 现象 实验 关键问题 手段 测序技术革命 NMR GC MS LC MS 2DE MS 基因组转录组蛋白质组代谢组 系统生物技术 DNADatabases Compare cluster integrate NewTheory structureandfunction NewApplication industrialprocessimprovement 数据有待积累理论有待建立最终必将突破 高通量解析工业生物过程 基因组 转录组回答为什么 WHY 蛋白质组回答如何进行 HOW 代谢组回答是什么 WHAT 回答工业过程的三个基本问题 ProteomicsMetabolomicsLipidomics 微环境 固定化 15mmh 15mm 固定化提高了紫杉醇的产量 固定化不同区域的细胞活性与产量的关系 紫杉醇合成活力 由外层到核心增加 细胞活力 由外层到核心降低 固定化细胞出现分化 AGPs表达 ChengJS LeiC WuJC YuanYJ JournalofBiotechnology 2008 133 1 96 102 Susp Immob ERK like磷酸化 固定化细胞的信号转导与调控 ChengJS YinDM YuanYJ EnzymeandMicrobialTechnology 2006 39 6 1250 1257 固定化细胞对MAPlike Kinases磷酸化响应及调控作用 ChengJS YuanYJ BiotechnologyandAppliedBiochemistry 2006 44 109 117 ChengJS YuanYJ Proteomics2006 6 2199 2007 2 DE和MS 细胞生长 生产与固定化微环境作用的关系蛋白质组 发现氮 硫和糖代谢相关的蛋白质与细胞分裂和次代谢产物之间的关系为细胞培养方式选择提供依据 蛋白组分析方法揭示固定化细胞时空异质性 Oxidativeresponseofcellsinducedbyshearstress HistochemicaldetectionofH2O2incellsbyDABstaining CelldeathwasevaluatedbyEvansBluestaining Changesoffouridentifiedproteinsinmediabasedon2 D Functionalcategoriesofidentifiedproteinsby2 DLC MS MS Functionalcategoriesofidentifiedproteinsby2 DLC MS MS J SCheng Y JYuan JournalofMolecularCatalysisB Enzymatic 2009 58 84 92 MetaboliteprofilingofTaxuscellsinresponsetoshearstressbyGC TOF MS TotalionchromatogramsofTaxuscellsforGC MSanalysis P PHanandY JYuan BiotechnologyProgress doi 10 1002 btpr 209 B LoadingplotgeneratedfromPCAanalysis D VIPplotfromPLSanalysis MultivariateanalysisbyPCAandPLS ScoreplotsfromPCA A andPLS C Variationsofintracellularmetabolitesundershearstress Atotalof65intracellularmetabolites Mmetaboliteabundanceontothemetabolicnetwork ShearstressinhibitingTCAcycleandNmetabolism Co inductionofglycolysisandaccumulationofcompatiblesolutes a 得分图 b 载荷图 PCA分析正常细胞和不同诱导子胁迫的诱导细胞 MeJA和Ce4 诱导东北红豆杉细胞磷脂酶的差异激活及下游脂质信号分子的信号转导模型 YangS LuSH YuanYJ BBA Mol CellBiol L 1781 2008 123 134IF 3 539 诱导子作用下红豆杉细胞膜磷脂代谢信号转导 PhospholipidomicsofTaxuscellsresponsingtoshearstress Negative ionLC ESI MSbasepeakchromatogramofphospholipidsfromTaxuscells40haftershearstresstreatment PG phosphatidylglycerol PE phosphatidylethanolamine PC phosphatidylcholine LysoPC lysophosphatidylcholine PA phosphatidicacid PI phosphatidylinositol PS phosphatidylserine Phospholipidcontentsinshearstress inducedTaxuscells ScoreplotsfromPCA A andPLS C B LoadingplotfromPCA D VIPplotfromPLS MultivariateanalysisbyPCAandPLS LysoPC Changesofbiomarkerphospholipids PA P PHanandY JYuan FASEBJ 200923 623 630 ActivationofphospholipaseD ActivationofphospholipaseC DefiningtheenzymaticsourceofPA AnalysisoflipidomicsofTaxuscellsinresponsetoshearstress Phospholipidcontentsinshearstress inducedT cells Decreasetotalphospholipids StructuralphospholipidssuchasPG PE andPC SterolsprofilesofT cells FattyacidsprofilesinT cells Variationsoffattyacidsundershearstress Increasevery long chainsaturatedFA IncreasemonounsaturatedFA DecreaseshortchainsaturatedFA Schematicchangesofsterolabundanceontotheplantsterolbiosyntheticpathway Theratiosofcampesterol sitosterol stigmasterol sitosterol andstigmasterol campesterolinshearstress inducedT cells Increasestigmasterolattheexpenseofsitosterolandcampesterol Theratiosbetweensterolsandphospholipidsinshearstress inducedT cells P PHan JZhou Y JYuan BiotechnologyandAppliedBiochemistrydoi 10 1042 BA20090102 合成生物学 syntheticbiology 是基于生命系统的工程技术 旨在设计 构建自然界不存在的生命或使已存在生命具有新功能 合成生物学研究如何设计和构建人工生命 依靠人工开发的基因密码 按照预定的方式运行生命 继人类基因组研究之后 生物领域一热门学科 是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现 合成生物学 Syntheticbiologyvscomputerassembly Productionofpaclitaxel EngineeredE coliforproductionofamorphadiene NatureBiotechnology21 796 802 2003 byJayDKeasling 4 Engineeredyeastforproductionofamorphadiene FPP积累 染色体水平修饰 tHMGR 双拷贝 ERG20 upc2 1过表达 阻断ERG9 ADS酵母表达 FPP转化二烯 青蒿CYP71AV1 CPR共表达 2006年 Keasling全新设计和合成了酿酒酵母中的青蒿素的代谢电路 成功实现了生产青蒿酸 EngineeredyeastforTaxolproduction CroteauRB etal BiotechnologyandBioengineering 2006 93 212 224 程景胜副教授肖文海韩培培杨松 NationalFundforDistinguishedYoungScholars 20425620 KeyProgramGrant 207360060 20236040 20706044 Acknowledgments 请您指正 谢谢 工程酵