催化反应动力学-2抑制动力学

酶学 Enzymology 第一节单底物反应动力学第二节抑制作用动力学第三节多底物反应动力学第四节别构酶动力学第五节pH和温度对酶催化反应速度的影响 主要内容 第四章酶催化反应动力学 第二节抑制作用动力学 变性作用 破坏酶蛋白的次级键 部分或全部改变酶的三级结构 抑制作用 某些化学试剂不引起变性 但能使酶蛋白分子上某些必需基团化学性质发生变化 引起酶活力降低或丧失 抑制剂 凡能降低酶催化反应速度的物质都称之为 特性 与酶的必须基团 包括活性基团及辅基 结合 改变影响其结构与性质 引起酶反应速度下降 它对酶有选择性 不包括酶蛋白的水解及变性失活作用 研究意义 对生物机体代谢途径 药物作用机理 酶活性中心内功能基团性质 酶构象维持基团性质 底物专一性 酶作用机理等研究的促进作用 抑制剂对酶活性的影响 抑制类型分类 1 不可逆抑制作用 irreversibleinhibition 与时间有关 指抑制剂与酶的活性中心发生了化学反应 抑制剂共价地连接到酶分子的必需基团上 阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团 不能用透析或稀释的方法使酶活性恢复 不可逆抑制作用相当于失活的酶浓度 又分专一性和非专一性不可逆抑制两类 前者和活性部位基团反应 后者和一类或几类基团反应 区分不是绝对的 非专一性抑制剂用途更广 2 可逆抑制作用 reversibleinhibition 与时间无关 抑制剂与酶蛋白以解离平衡为基础 以非共价方式结合 引起酶活性暂时性丧失 抑制剂可以通过物理方法 如透析等 被除去 并且能部分或全部恢复酶的活性 这种作用称为可逆抑制作用 可逆与不可逆的区分 1 一定量抑制剂与酶溶液混合 预保温后取不同量的混合液测定其初速 用反应初速度对酶浓度作图 区别 一 2 抑制剂一定量 用不同酶浓度测活 同 1 作图 区别 二 消除不可逆抑制剂 不可逆 可逆 斜率减小 3 抑制剂不同量 作初速度与酶浓度关系图 区别 三 v E I I3 I2 I1 I0 I0 I1 I2 I3 消除不可逆抑制剂 非专一性不可逆抑制 非专一性不可逆抑制剂可对酶分子上每个结构残基进行共价修饰而导致酶失活 这类抑制剂主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂 可与氨基 羟基 胍基 酚羟基等反应 如烷化巯基的碘代乙酸等 重金属Hg2 Pb2 Cu2 三价砷等 一 不可逆抑制作用 一 非专一性不可逆抑制剂 1 酰化试剂 酸酐 乙酰咪唑等 作用基团 氨基 羟基 酚基 巯基2 烷化试剂 带有活泼卤素原子 易烷化亲核侧链基团 2 4 二硝基苯氟等 作用基团 氨基 巯基 羧基 硫醚等 其中最主要的是含卤素的化合物 如碘乙酸 碘乙酰氨 卤乙酰苯等 它们可使酶中巯基烷化 从而使酶失活 常用作鉴定酸中巯基的特殊试剂 巯基酶碘乙酸胺失活的酶 3 有机磷化合物 能与酶活直接相关的丝氨酸上的羟基结合 抑制蛋白酶与酯酶 例 抑制神经系统的胆碱酯酶 使乙酰胆碱不能分解而堆积引起神经中毒 二战中使用的毒气DFP 有机磷杀虫剂 敌百虫 由于乙酰胆碱堆积 使神经处于过渡兴奋状态 引起功能失调 导致中毒 如昆虫失去知觉而死亡 鱼类失去波动平衡致死 人 畜产生多种严重中毒症状以至死亡等 但对植物无害故可在农业 林业上用作杀虫剂 有机磷化合物有时可用含 CH NOH基的肟化物 或羟肟酸R CHNOH化物将其从酶分子上取代下来 使酶恢复活性 故将此类化台物称为杀虫剂解毒剂 如常用的解磷啶 PAM 就是其中的一种 非专一性不可逆抑制剂 4 亲电试剂 缺乏电子试剂 有氧化能力 四硝基甲烷作用基团 酚基 非专一性不可逆抑制剂 5 有机汞 有机砷化合物 和巯基作用 1 对氯汞苯甲酸 加入过量巯基化合物如半胱氨酸解除 路易斯毒气作用机制 2 三价有机砷与辅酶硫辛酸作用 抑制了丙酮酸氧化酶系统 可被过量双巯基化合物如二巯基丙醇解除 非专一性不可逆抑制剂 6 氧化还原剂 光敏剂氧化 作用于巯基 硫醚基 酚基等 还原剂有巯基乙醇等 作用于巯基 7 氰化物 与含铁卟啉的酶中的Fe2 结合 使酶失活而阻抑细胞呼吸 木薯 苦杏仁 桃仁 白果等都含有氰化物 以及工业污水和试剂中的氰化物等进入体内 均可造成严重中毒 临床上抢救氰化物中毒时 常先给注射亚硝酸钠 使部分HbFe2 氧化生成HbFe3 而夺取与细胞色素氧化酶 Cyta3 结合的CN 生成HbFe3 CN 再注射硫代硫酸钠 将由HbFe3 CN 中的CN 逐步释放 在肝脏硫氰生成酶的催化下转变为无毒的硫氰化物 随尿排出 从而解除其抑制 8 重金属 Ag Hg2 Pb2 Cu2 Fe2 Fe3 等 在高浓度时可使酶蛋白变性失活 低浓度时可与酶蛋白的巯基 羧基和咪唑基作用而抑制酶活性 应用金属离子螯合剂如EDTA 半胱氨酸或焦磷酸盐等将金用离子螯合 可解除其抑制 恢复酶活性 9 青霉素 抗菌素类药物 与糖肽转肽酶活性部位Ser OH共价结合 使酶失活 非专一性不可逆抑制剂 10 生物自由基对酶类的作用自由基 Freeradical FR 是指能独立存在的含有一个或一个以上未配对电子 即外层轨道上具有奇数电子 的原子 原子团 分子或离子 未配对电子的存在赋予自由基以顺磁性和高度化学反应活性的特点 且总有变为成对电子的倾向 因而性质极不稳定 常易发生丧失或得到电子的氧化 还原反应 其中作用最广 研究最多的当属含氧自由基 或称活性氧 过量自由基产生可造成机体细胞非特异性氧化损伤 如引起DNA碱基修饰 链断裂 酶蛋白变性失活等 从而关联到多种疾病病理生理过程 非专一性不可逆抑制剂 生物自由基对酶分子的不可逆抑制作用是广泛的 例如 可修饰GSH PX活性部位的一个巯基与其相邻的Se元素 攻击活性部位的 SH使之失活 在酶蛋白分子中 蛋氨酸 组氨酸 酪氨酸 色氨酸 脯氨酸 半胱氨酸和苯丙氨酸等最易受到自由基的攻击而被氧化 这是由于它们具有不饱和性质 如组氨酸的咪唑基 酪氨酸的酚羟基 色氨酸的吲哚基等 酶不可逆抑制动力学判断必需基团性质和数目 建立于动力学基础上 按伪一级反应处理 方法核心 分别测定蛋白质修饰反应中 基团被修饰的反应速度和蛋白质失活的反应速度 用半对数法比较两者反应速度常数 判断必需基团性质和数目 1 Ray Koshland法 2 邹氏作图法 以统计学为基础 根据必需基团与非必需基团与试剂作用的反应速度和其它性质不同将化学修饰分六种 1 修饰试剂仅作用于一类基团且必需基团与非必需基团作用速度相等 2 同类基团中 必需基团与非必需基团作用速度相差很大 3 同类基团中 必需基团与非必需基团作用速度不等但相差不大 4 必需基团已全部被除修饰的酶分子尚有残余活力aT 5 同类基团中保留其中之一即保有全部活力 6 试剂作用于两种不同侧链基团 二者均含有必需基团 本是描述蛋白质功能基团的化学修饰与其生物活性之间定量关系 也可用来判断必需基团的性质和数量 邹氏作图法 判断必需基团的性质和数量可通过测定酶活力降低程度和侧链基团被破坏程度之间的关系加以分析得出 邹氏作图法 第 1 种情况例 测定不可逆抑制剂作用过程的酶活力剩余分数a的同时测定某一种必需基团的剩余分数x 同类基团有i个是必需的 若这些基团反应速度相等 只有那些i个必需基团都没有被破坏的酶才能保存活力 取对数得 法一 剩余活力百分数i次方根与基团剩余百分数作图有直线关系 以lga对lgx作图得一条直线 从而求出该必需基团的数目 法二 假设一系列i值 以a1 i x作图 能获得直线的i即为必需基团数目 i 1 i 2 对羟基甲酰甲醛修饰牛胰核糖核酸酶 二 专一性不可逆抑制作用 根据底物的化学结构设计 具有和底物类似的结构 还带有能和活性部位其它基团结合的基团 又称亲和标记试剂 选择性来源于与活性和非活性部位形成络合物的解离常数比值 1 Ks型不可逆抑制 Ks型的判断 1 化学计量 酶活全丧失 2 底物 竞争性抑制剂具保护作用 3 使酶可逆失活 失活后即不与不可逆抑制剂作用 应用 通过对酶蛋白亲和标记来研究酶活性中心结构 原理 抑制剂上引入特殊光学性质的基团 而这些基团可反应酶分子局部微环境区的不同 称之为 报告基团 例 胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的底物与不可逆抑制剂比较 前者底物有一带正电荷的侧链 后者底物要求具一芳香性的侧链 Ia 对甲苯磺酰 L 苯丙氨酰氯甲酮 IIa是抑制剂 Ib 对甲苯磺酰 L 苯丙氨酰甲酯 IIb是底物 Ia和IIa Ib和IIb具相同结合基团 不同的是Ia IIa具一个活泼氯甲基 被羰基活化后可作为烷化剂与酶活性部位基团作用 图4 14 R C CHCl2 R C CH3 抑制剂 底物 2 Kcat型不可逆抑制剂 根据酶催化过程设计 对酶作用机制有预了解 与底物相似的与酶结合和被酶催化反应性质 还具一个潜伏基团 潜伏基团活化与活性中心共价结合使之停留在此结合状态 不能再分解生成产物 酶因而致 死 此过程称酶 自杀 失活作用 Ss为自杀性底物 Is为Ss被酶催化后的抑制物 过程如下 特点 Ss单纯与E结合还不能成为抑制剂 只有转化为产物I后Is后才可 Kcat越大生成产物数也越快 抑制作用越强 Kcat更重要 1 SS浓度越大抑制作用也越大呈一级反应 2 最适用pH与底物的一致 3 SS过量时 酶量越多抑制作用越强 4 SS本身无抑制活性 生成的Is是一种亲和标记的抑制剂 5 必需基团与Is化学计量关系是1 1 6 真正的底物能竞争性阻断Ss的抑制作用 例 羟基癸酰硫酯脱水酶 催化羟基癸酰硫酯脱水并催化产生的 顺式和 反式双键两种化合物转变 3 4 癸炔酰 N 乙酰半胱胺为其不可逆抑制剂 其炔基可转化为具有连丙二烯结构化合物 此化合物可烷化活性中心有关基团 与黄素有关的单胺氧化酶和以哆醛为辅基的酶都能被有关炔类化合物以这种方式不可逆抑制 H 医学应用 酶不但可作出了为治疗手段 同时也可作为靶子使致病菌或异常细胞中某些酶被特定化合物抑制失活 从而使病菌或异常细胞死亡 酶失活剂对人体有毒 而自杀底物与酶天然底物一样对人体无毒 故有极高医学价值 1 迫降灵是线粒体上单胺氧化酶自杀底物 肠道吸收的代谢产物酪胺在酶被 杀死 后进入血液循环成为假神经递质 导致血压下降 2 癫痫病的治疗人脑中氨基丁酸转氨酶破坏脑中抑制性神经递质氨基丁酸 导致癫痫病发作 乙烯代氨基丁酸可杀死该酶 此酶被杀死后 氨基丁酸量增高 脑中枢受抑 从而治疗了此病 二 可逆抑制作用 可逆抑制剂与酶结合后产生的抑制过程可依米氏学说加以推导 定出其定量关系 可逆抑制的动力学关系由抑制剂与酶的解离常数Ki和抑制剂的浓度决定 一些重要的可逆抑制剂 最重要的是竞争性抑制剂 如 磺胺药 TMP 氨基叶酸等 用增加底物浓度的方法可以减弱抑制作用 磺胺药物的作用机制 根椐抑制剂与酶结合的情况 可逆抑制分为以下几种类型 竞争性抑制 link 非竞争性抑制 link 反竞争性抑制 link 线性混合抑制 link 底物抑制 link 附 产物抑制 link 附 激活剂 link go 一 竞争性抑制作用 competitiveinhibition 某些抑制剂的化学结构与底物相似 因而能与底物竟争与酶活性中心结合 当抑制剂与活性中心结合后 底物被排斥在反应中心之外 其结果是酶促反应被抑制了 指抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用 互相排斥 特征 1 结构与正常底物相似 2 不形成EIS三联复合物 3 一旦形成EI后 由于I缺少具反应活性的基团或位置不当 形成死端复合物 dead endcomplex 竟争性抑制作用的例子 例 琥珀酸脱氢酶受丙二酸之抑制 丙二酸是二羧酸化合物与琥珀酸结构相似但两个羧基间无法形成双键无法完成后续反应 竞争性抑制图解 I 竞争性抑制动力学推导 根据稳态学说 d E dt k2 k 1 ES k 3 EI k1 S k3 I E 0 d ES dt k1 E S k2 k 1 ES 0 由 1 得 4 由 2 得 3 将 3 代入 4 可得 5 1 2 又因为 v k2 ES Vm k2 E0 将所有的项数换成 ES 项 代入相关式子可得 v Vm ES E0 ES E ES EI 6 33 其中 Km k2 k 1 k 1 Ki k 3 k3 6 34 此即为竞争性抑制动力学方程式 形式与米氏方程相同 故 分析 1 Ki是EI复合物的解离常数 Ki愈小 表示抑制强度越大 也称抑制常数 2 Km 表观 Km 1 I Ki 比米氏方程Km大 意味着酶与底物亲和力减低 3 Vm不变 初速度方程 忽略ES EI 得 引入抑制剂浓度函数 则可得 做不同a的米氏方程 当 S 趋于 V0趋于Vmax 总结 抑制方程推导通用思路 总酶 E0 E ES EIS 即酶存在的不同形式之总和 通过Ki Ks等将酶的不同形式与 ES 挂勾 即 E x1 ES EIS x2 ES 最后得 E0 xn ES 根据酶催化速度通式条件 v0 k2 ES Vm k2 E0 得 v0 Vm ES E0 xn得 v xn Vm 最后将结果化成与米氏方程相类似的结构 II 曲线特征 双倒数作图法 一次作图 将速度方程变双倒数形式 1 v0 1 S0 作图 得一直线 斜率 aKm Vmax纵截矩 1 Vmax横截矩 1 aKm由此得Vmax和Km 竞争性抑制剂对反应的影响如图6 6 a b 加入竞争性抑制剂后 Km变大 酶促最大反应速度不变 无抑制剂 竞争性抑制剂 1 Vmax 1 v 1 s 竞争性抑制作用的动力学特征 说明 抑制剂与底物在酶上结合位点不同时也可产生竞争性抑制 此情况为 底物或抑制剂与酶结合均会改变酶构象使之不能形成三元复合物 见图4 7所示 III 抑制常数Ki确定 1 根据表观米氏常数计算 2 表观米氏常数Km 对 I0 作图法 先做不同I下双倒数直线 得到不同I下一次作图的斜率yi 做y I0 仍是直线 从该直线中可看出 斜率 Km vmaxKi纵截矩 Km vmax横截矩 Ki 一次作图 双倒数作图 3 二次作图法 竞争性抑制剂存在下 双倒数转变形式 固定S 1 v0 I0 作图得一直线分析 I0 Ki时 1 v0 1 Vmax 与 S0 无关 固定酶浓度 改变底物作几条直线相交于一点 Ki 1 Vmax 即方程通过定点 Ki 1 Vmax Dixon作图确定竞争性抑制剂常数 4 33 4 Dixon作图法 Si Dixon作图其它意义 还可鉴定该抑制剂对酶的抑制类型 由式4 33知Dixon图斜率 y Km VmaxKi S0 做y 1 So 直线过原点 二次图 因此一个抑制剂若作Dixon图其斜率再作二次图得到的直线过原点则说明此抑制剂为竞争性抑制剂 可与非竞争性区分但不能与混合型抑制区分 y 1 S IV 非线性竞争性抑制 一 二次做图均为直线 故称线性竞争性抑制 若抑制剂与酶活性中心结合数不止一个 则二次作图不为线性 最简单情况 结合两个时 二次作图为抛物线 故称抛物线竞争性抑制 back Ki k3 k 3 E I EI Ki EI I Ei2 类似 抑制剂结位不同于底物结合位 但仍引起酶与底物亲和力下降 是双曲线竞争性抑制 二 非竞争性抑制作用 noncompetitiveinhibition 酶可同时与底物及抑制剂结合 引起酶分子构象变化 并导至酶活性下降 由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合 所以称为非竞争性抑制剂 酶分子可以和抑制剂I结合 生成EI 也可和底物S结合 生成ES 可生成无活性的ETS 如某些金属离子 Cu2 Ag Hg2 以及EDTA等 通常能与酶分子的调控部位中的 SH基团作用 改变酶的空间构象 引起非竞争性抑制 非竞争性抑制图解 反应式 仅讨论抑制剂与酶催化部位或构象变化影响到催化部位而导致酶活性之丧失情形而不影响到底物与酶之结合 线性非竞争模型是最简单的情况 此时E IEI及ES IESI具相同解离常数Ki 根据稳态学说 可得 4 37 可见非竞争性抑制影响到了最大反应速度 使Vm下降 而Km不变 抑制剂的存在使总酶浓度下降故使Vmax下降 而抑制剂不影响底物与酶的结合能力 故Km不变 E S Ks ES E Ks ES S E I Ki EI EI E I Ki Ks ES I Ki S ES I Ki EIS EIS I ES Ki 又 代入各项约去 ES I推导 附 形式化为 公式类似于顺序机制 双底物反应 II 线性非竞争性抑制双倒数方程曲线特征 以1 v0 1 S0 作图 斜率 a Km vmax 纵截矩 a vmax 横截矩 1 Km 可得vmax Km 不同抑制剂浓度作图交于横轴 1 Km处 这是非竞争性抑制特征 非竞争性抑制剂对酶反应的影响 如图6 7 a b 加入非竞争性抑制剂后 Km不变 而Vmax减小 非竞争性抑制 无抑制剂 非竞争性抑制剂 1 km 1 v 1 s III 抑制常数Ki 双倒数一次作图斜率y 1 以1 v max I0 作图 为线性 横轴截矩为 Ki 二次作图法 一次作图 2 或以y a Km vmax I0 也为线性 横轴截矩为 Ki 二次作图 一次作图 Dixon作图法确定Ki 同样 双倒数方程化为 以1 v0 I0 作图 固定 E0 S0 横轴截矩 Ki 线性非竞争性抑制是一般非竞争性抑制的特例 单底物酶促反应中此实例较少 更多是不可逆抑制 back 三 反竞争性抑制作用uncompetitiveinhibition 抑制剂不能和游离酶结合 只和酶底物复合物ES结合成无活性的三元复合物ESI 也是说S和E的结合不仅不排斥I 反而促进了I和E的结合 在多元反应体系中常见 此原因在于底物结合暴露了抑制剂结合部位或抑制剂与酶结合底物直接结合 I 推导方程式 Ks Km 6 36 可见反竞争性抑制剂可使得Vm和Km都发生变化 相应降低同一个倍数 II 双倒数方程及曲线特征 令a 1 I0 Ki 反竞争性抑制双倒方程 1 v0 1 S0 作图 直线 斜率Km vmax 不同抑制剂浓度下斜率一样故呈一簇平行线 此为反竞争性抑制特征 反竞争性抑制对酶反应动力学影响如图6 8 a b 反竞争性抑制 无抑制剂 反竞争性抑制剂 1 1 S 1 km 1 I ki 加入反竞争性抑制剂 使Km和Vmax均减小 I增加 可逆抑制的动力学比较 抑制类型VmaxKm无抑制剂VmaxKm竞争性抑制作用不变变大非竞争性抑制作用变小不变反竞争性抑制作用变小变小 III 抑制常数Ki 也用二次作图法 注 不是斜率y 在双倒数图中读取1 v max 1 K m 根据关系式 作1 v max I0 作1 K m I0 back 四 线性混合型抑制 基本上与非竞争性抑制剂相似 但KsKs KiKi 反应式可表示如下 4 44 Km Ks I 根据快速平衡学说 可推导如下动力学方程式 II 双倒数方程 定义a 1 I0 Ki a 1 I0 K i 则4 44为 双倒方程为 1 v0 1 S0 得直线 不同抑制剂浓度交于一点Kia则交于第二象限 竞争 非竞争 Ki K i a a则交于第三象限 非竞争 反竞争 混合型抑制剂对酶反应动力学的影响如图6 9 a b III 抑制常数Ki K i 双倒数一次作图读取数据 纵截矩1 v max 斜率aKm vmax 根据式子作图 1 v max I0 斜率y I0 由图可见 均为线性 横轴截矩为 Ki Ki 讨论 1 K i 竞争性抑制 2