山东半岛沿海地区腐生真菌种类和分布研究

山东半岛沿海地区腐生真菌种类和分布研究 摘要 本文主要对山东半岛沿海岸地区腐生真菌的种类和分布进行了初步研究 2010 年 6 月至 2010 年 10 月 从威海 青岛 烟台等近海岸地区进行了枯朽木生植物标本的采集 所 采标本装入无菌的塑料袋中带回实验室 采用直接检查法和湿室诱培法进行检查鉴定 共观 察了 30 多份标本 初步鉴定出 3 个属的 5 个种 包括 Diaporthe syngenesia Diatrypella favacea Diatrypella quercina Pleospora calvespora Pleospora epilobii 该研究结果对于山东 半岛沿海地区的腐生真菌资源的保护和利用具有重要意义 关键词 山东海岸 腐生真菌 形态特征 种类分布 Types and distribution of Saprophytic Fungi from the Coast of Shandong Peninsula Student majoring in Plant Protection Sunjunchao Tutor Lubingsheng Abstract This paper is mainly about the types and distribution of the kinds of saprophytic Fungi collected from the coast of Shandong Peninsula About more than 30 specimens were collected from Weihai Qingdao Yantai coasts from June 2010 to October 2011 and examined in the past more than 3 monthes The specimens were brought back to the laboratory in the sterile plastic bags and were examined directly while they were still fresh and moist under stereo microscope or incubated in the moist boxes Three genera and five species of saprophytic fungi from the coast of Shandong Peninsula were identified Three genera are Diaporthe Diatrypella Pleospora and five species are Diaporthe syngenesia Diatrypella favacea Diatrypella quercina Pleospora calvescens and Pleospora epilobii Key words Shandong coast saprophytic fungi morphological feature types and distribution 1 引言 真菌 低等的真核生物 以分解吸收为营养方式 常具有分枝繁茂的丝状 营养体 产生大量孢子来进行有性和无性繁殖 真菌作为分解者在自然生态系 统中起着极其重要的作用 维持自然界物质能量的转化循环 真菌的种类丰富 分布广泛 存在于土壤 水体 空气 生物体内外及其残骸中 营腐生 寄生 和共生生活 除此之外 一部分真菌可造成动植物病害 还有一些可与其它生 物共生 互惠互利 某些真菌的代谢产物可被开发利用 广泛应用于工业 农 业 食品发酵 医药及化学等工业上 1 对于脊椎动物 高等植物和昆虫种类的研究调查方面 我国的研究者做了 大量工作 然而已知的真菌物种与估计的相比少之又少 这与我国的生物多样 性是不相称的 在真菌生物多样性研究方面 与其他国家相比我们的研究工作 落后许多 有些甚至不能准确地说出我国或任何一个地区的真菌物种种类 2 自然界已知的的真菌大约有 150 万种以上 Hawksworth 1991 这其中的 7 万多种真菌已经被人们研究认识和描述过 有专家研究统计 我国的真菌物 种数有 18 万种以上 大部分专家认为从我国的地理位置来看 我国的真菌物种 可达 20 25 万种 也就是说这是一座还未开发以及迫切需要开发的宝藏 3 根据戴芳澜教授的 中国真菌总汇 1979 中记载 我国已知真菌物种只 约 7000 种 现知种数只占全国估计数的 3 左右 4 而且我国在菌物物种分类 研究上空白多 起步晚 家底不清 比我国的国土面积小得多的英国和瑞典 已 调查研究的真菌种数就比我国多得多 即使是印度的真菌数量也是我们的两倍 而且在真菌系统中有 100 多个目 我国所涉及的研究的连这个数的一半都不到 许多目 科的真菌在国外已有专著 而在国内却一无所知 2 真菌的分类的研究是基本的物种研究 是生物多样性研究的基础 而我国长 期以来对于有关研究工作不够重视 甚至有不在行的专家或者自以为在行的专 家对分类研究存在很深的误解和错误的指责 还有的认为具有生产利用价值的 才是资源 用途不明的不必浪费时间 精力和资源去进行分类研究等等 总之 他们不理解真菌分类研究的重要性以及必要性 导致我国的真菌分类的研究工 作进展不甚理想 事实上就真菌物种的价值往往不限于其简单的生产利用价值 5 物种多样性需要真菌分类研究来支撑 如果不作真菌系统分类研究 其物 2 种多样性只是一句空话 也就谈不上真菌资源的合理开发利用以及种质资源的 保护和利用等一系列问题 经过多年来国内外学者们的共同努力 真菌分类已经发展成为一门基础学科 真菌分类学在真菌学乃至整个生物学的研究中起到非常重要的地位 并且与其他 相关学科具有密切的联系 作为一门有 300 多年的历史的传统研究学科 其分类 方法也伴随着科学技术的发展而与时俱进 在研究中常用的方法主要有常规形态 分类法 电镜技术分类法 数值分类法 化学分类法和分子生物学分类法 6 同时 分类技术也呈现出多样化 而且 DNA 和 PCR 等分子方面的高科技的技术也 应用于分类研究上 这就提高了真菌鉴定的准备性 但是现代真菌分类学的基础 还是真菌形态学 在应用分子生物学技术时首先必须对真菌进行准确的鉴定 如果 形态鉴定本身不准确 那么用分子生物学技术进行的分类就成了无本之源 同样 用分子生物学性状可以验证形态学特征的可靠性和增加我们对形态学性状进化的 了解 二者是辨证统一的关系 现代真菌分类学正向全形态过渡 对分类方法的要 求是 简单并且容易操作 可以重复操作 重复性好 分型性要高 对于 各种类型具有分辨性 分辨力强 具有特定的形态分类 成本要求低 同时 真 菌分类必须结合其真菌的形态特征 生态学 分子生物学特性 新陈代谢 解剖 学特性 结构等综合因素考虑才能达到要求 因此 在具体分类工作中 应该根据 物种的各个形态和性状找出物种间彼此的相关性关系 7 充分挖掘物种的形态学 性状 生理性状 生化性状和分子生物学性状等信息 综合分析 这样才能建立自 然的生物进化系统关系 9 常规形态分类法即形态鉴定方法还是目前真菌分类中最常用的方法 其原 理主要是用普通光学显微镜对真菌进行形态观察和特征描述 依靠真菌的形态学 和解剖学特征对真菌进行分类 电子显微镜的出现与应用给真菌学的研究提供 了一个分辨率更强的工具 用来观察真菌的细微结构和亚显微结构 使人们能更 深入地认识真菌的细胞壁 隔膜 细胞核 鞭毛和孢子饰纹等 化学分类就是 根据真菌的化学特征对其分门别类 即以其化学成分的种类 结构和性质等特性 为依据 以传统分类为基础对真菌进行分类 能从本质上揭示生物种间的系统发 育和亲缘关系 使分类更接近自然状态 近年来以分子生物学技术为代表的多门 新兴学科和技术的引入为真菌分类学发展提供了良好的机遇 14 3 腐生真菌作为真菌中的一大类 不仅在自然循环中起着重要作用 而且在分 类中占有重要意义 腐生真菌是一类从无生命的有机质中吸取营养物的真菌 在 自然界中广泛存在 主要是从动植物的遗体 动物和植物的脱落物 如落叶 枯 枝 树根以及动物的粪便和毛发等获得营养物质 15 腐生真菌的特点是繁殖快 生存能力强和形态多样等 正是由于腐生真菌的特点 在它们当中许多种类具有 潜在应用价值 腐生真菌大多数生活在土壤中或动植物残体等基质上 通过对有 机化合物的降解使物质分解或腐化 促进自然界的碳循环 因此人们越来越关注 腐生真菌 其研究也成为国内外研究的热点之一 在自然生态系统中 腐生真菌是一类特殊的功能类群 腐生真菌是作为分 解者的身份在生态系统中起到非常作用 8 主要参与生态系统中一些废物 生 态系统中植物的残体以及所产生的凋落物 动物的尸体和排泄物等 的分解过程 腐生真菌与绿色植物一样 在生态系统中的作用同样是不可缺少的 可以想象 如果没有腐生真菌的存在 生态系统会被自身所产生的垃圾所覆盖 的自然界 就失去其丰富多彩性 所以 弄清楚腐生真菌的分类 对其种类的应用和开发 也有重要意义 本研究所用标本均采集于山东半岛沿海地区 山东半岛是中国第一大半岛 位于山东省东北面 以羊口 秀珍河为临界 半岛三面临海伸入黄海与渤海之间 丘陵和低山占总面积的 70 丘陵海拔大部分在 200 公尺左右 有数列东北 西 南走向的山岭 海拔在 500 1000 公尺 以崂山最高 沿海地区有海积平原 面 积不足 30 半岛地区的海岸线曲折 多海湾 岬角和岛屿 山东半岛气候属 暖温带湿润季风气候 1 月均温 3 1 8 月均温约 25 极端最高温约 38 10 以上活动积温为 3 800 4 100 年降水量为 650 850 毫米 半岛 南侧地区的降水量在 800 毫米以上 西北地区的滨海平原的降水量为 600 毫米 年降水量的 60 集中于夏季 且强度大 常出现暴雨 降水年均相对变率约 20 年均相对湿度在 70 以上 半岛沿海东侧 4 7 月多海雾 年均雾日 30 50 天 10 正是由于山东半岛独特的地理环境和气候条件 造就了其丰富 的种质资源 植物种类与数量很多 因此在其上生长的腐生真菌也具有有研究价 值 该区的微生物的种类相对较多 为真菌的研究提供了各种珍贵的自然资源 4 因此这一地带的标本资源丰富 诸多标本具有代表性 由此也能看出这里独特的 自然资源和宝贵的真菌的原料 但是 对于该地区的腐生真菌的报道很少 与其 丰富的真菌资源尤其是腐生真菌资源的实际情况极不相衬 本研究旨在通过标本 采集和腐生真菌的种类鉴定 逐步对山东沿海地区腐生真菌的种类与分布进行研 究 以便更好地保护和利用这些腐生真菌资源 1 材料与方法 1 1 采样地点 2010 年 6 月至 2010 年 10 月 在威海 青岛 烟台等近海岸地区 进行了 腐生真菌标本的采集 所采标本均装入无菌的标本塑料袋中 带回实验室以待检 查鉴定 1 2 方法 1 2 1 真菌的采集方法 在树林和枯木丛中直接采集植物碎屑 包括木块 枝条 茎杆等 装入标本 采集袋 同时将采集人 采集地点以及采集时间等事项用记号笔注明 回到实验 室后将标本放在密封性好的无菌塑料盒子中 在盒子底部平铺几层湿润的滤纸进 行保湿 密封后在室温下保存 3 7 天 期间随时检查和观察真菌 11 1 2 2 真菌的检查方法 直接检查法 将标本放于连续变倍体视镜下检查 并在标本上用记号笔标出 子实体的位置 对检查到的真菌直接挑取分离做玻片 观察并描述真菌的形态 测量孢子的大小 并对各个部位进行照相 将检查到的有真菌存在的标本 贴好 标签纸记录下采集地 采集时间等信息后放入标本袋中 湿室诱培法 12 对于子囊发育不成熟 未发现子实体或孢子未形成的标本 将标本放入消毒后底部铺有灭菌湿滤纸的保湿缸中 室温下培养 6 周后开始定 期检查 持续一个月 期间注意定期检查保湿情况 若发现木材干燥 及时补充 水分 1 2 3 真菌的制片方法 制作临时玻片 准备好玻片 浮载剂用无菌水 用挑针挑取子实体放于无菌 水中 需对附属丝或胶质鞘观察时用蓝墨水染色液染色 由于用无菌水作浮载剂 5 易干燥 在显微镜下检查时须及时对玻片补充水分 以防玻片过于干燥 影响观 察和拍照 制作永久玻片 11 对于已经观察完的玻片需制成永久玻片进行保存 常用 的方法 在盖玻片的边缘滴一滴乳油 0 05ml 乳油会慢慢渗入到盖玻片下代 替淡水做浮载剂 然后将载玻片放入 50 左右的烘箱中进行烘片 等多余的乳 油挥发后 取出玻片后用中性胶封片 封片剂完全干燥后 放入玻片盒中保存并 注明信息 1 2 4真菌的鉴定方法 在体式镜下观察标本上子实体的形态 对于已经成熟的子实体 挑取并在显 微镜下测量子囊和子囊孢子的大小或者分生孢子的大小 16 观察其形态 颜色 并做好记录 所有真菌均在 OLYMPUS SZ II 体视镜下检查挑取制片 所有标本均 在尼康 ALPHAPHOT 2 YS2 显微镜下观察 测量 照相 本论文的真菌分类地 位及种的记录数均参照 Index Fungorum 进行鉴定 13 1 3 仪器 OLYMPUS SZ II 体视镜 三星 VLUU L730 数码照相机 挑针 尼康 ALPHAPHOT 2 YS2 显微镜 无菌操作台 玻片等 2 结果与分析 经过 5 个月的观察和鉴定 共鉴定出 5 种腐生真菌 其描述和图版如下 2 1 间座壳菌属 Diaporthe Nitschke Pyrenomycetes Germanici 2 240 1870 特征 子囊座发达 黑腐皮壳型或真腐皮壳型 在皮层内形成 铺展型 由 基物变质而成 不呈鲜色仅存黑色边缘 寄生于枝干 少数生于枝条 子囊壳以 长颈伸出于座 子囊果壁亚革质 内部灰色 有长喙 子囊梭形 有或无侧丝 子囊孢子双细胞 含油球 2 4 个 长圆形至梭形 无色 无性世代常为拟茎点霉 产生椭圆形或卵形的分生孢子和线形的柄生孢子 模式种 Diaporthe angelicae Berk Wehm Nitschke 1870 分类地位 子囊菌门 Ascomycota 粪壳菌纲 Sordariomycetes 间座壳菌目 Diaporthales 间座壳菌科 Diaporthaceae 间座壳菌属 Diaporthe 2 1 1Diaporthe syngenesia Fr Nitschke ex Fuckel Jb nassau Ver Naturk 23 24 6 204 1870 1869 70 图1 特征 子囊壳直径 1mm 埋生在子座内 7 15 个聚集丛生 具长颈竖直露出 壁亚革质 内部灰色 有长喙 子囊 45 56 8 12 m 梭形 柄短 多孢子 无 侧丝 子囊孢子 12 12 2 3 5 m 双细胞 末端稍尖 成熟后 1 个隔膜 含油 球 2 个 梭形 无色透明 标本信息 采集地 青岛城阳棉花社区 采集时间 2010 07 18 采集人 于辉霞 图 1 Diaporthe syngenesia A 基质上的子囊座 B 染色的子囊 C 子囊 D 未成熟的子 囊 E F 子囊孢子 标尺 A 1000 m B F 20 m Fig1 Diaporthe syngenesia A Ascoma on the host surface B Colored ascus C Ascus D Immature ascus E F Ascospores Bars A 1000 m B F 20 m 7 2 2 假蕉孢壳属 Diatrypella Ces De Not De Not Sfer Ital 29 1863 特征 子囊座大多发达 穿皮壳形 多少与蕉孢壳相似 逐渐外露 聚集 埋生在发达的真子座或假子座 常具长颈 孔口具沟槽 囊间组织由柱形的侧丝 构成 子囊具长柄 顶端近平截 长棍棒状 无色 单层壁 有柄 侧丝呈丝状 且有隔膜 子囊孢子腊肠形 无性世代为盘明针孢 无性型为腔孢菌 为枝干上 的腐生菌或寄生菌 分布广泛 模式种 Diatrypella verruciformis Ehrh Nitschke Pyrenomycetes Germanici 1 76 1867 分类地位 粪壳菌纲 Sordariomycete 炭角菌亚纲 Xylariomycetidae 炭角菌 目 Xyariales 蕉孢壳科 Diatrypaceae 假蕉孢壳属 Diatrypella 2 2 1 桦小蕉孢壳Diatrypella favacea Fr Ces De Not Schema di Classif Sferiacei 1863 图2 特征 子囊壳直径约 0 8mm 近球形 单生或群生 埋生或半埋生在基质上 孔口的颈部竖直露出 一直延伸到基质的外面 子囊 123 157 11 14 m 平均 125 16 m n 20 长棍棒状 无色 单层壁 有柄 内多孢子 侧丝呈丝状 且有隔膜 子囊孢子 7 8 1 2 m 平均 7 2 m n 20 孢子无数 不规则的堆 积 淡黄色 单细胞 腊肠状 12 标本信息 采集地 烟台昆嵛山 采集时间 2010 08 19 采集人 于辉霞 2 2 2 栎小蕉孢壳Diatrypella quercina Pers Cooke J Bot Lond 4 99 1866 图3 特征 子囊座直径约 2mm 垫状 黑褐色至黑色 子囊壳直径约 0 6 0 7mm 埋生在发达的子座内 具长颈竖直露出 孔口具沟槽 子囊 108 140 11 15 m 长棍棒状 多孢子 无色 单层壁 有柄 侧丝呈丝状且有隔 膜 子囊孢子 8 12 2 3 m 淡黄色 单细胞 稍弯曲 腊肠状 孢子无数呈 不规则的堆积 标本信息 采集地 威海乳山岠嵎山 采集时间 2010 08 07 采集人 于 辉霞 8 图 2 Diatrypella favacea A 基质上的子囊座 B C 子囊束 D E 子囊 F G 子囊孢子 标 尺 A 1000 m B 100 m C 50 m D G 20 m Fig2 Diatrypella favacea A Ascoma on the host surface B C Asci D E Ascus F G Ascospores Bars A 1000 m B 100 m C 50 m D G 20 m 2 3 格孢腔菌属 Pleospora Rabenh ex Ces De Not 1863 特征 子囊座球形 黑色 顶部光滑而无刚毛 子囊圆筒形 内含孢子 8 个 子囊孢子卵形 壁砖状分隔 无色或黄褐色 有拟侧丝 孢子无附属丝 模式种 Pleospora herbarum Pers Rabenh ex Ces De Not 1863 分类地位 座囊菌纲 Dothideomycetes 格孢腔菌目 Pleosporales 格孢腔菌 科 Pleosporaceae 格孢腔菌属 Pleospora 9 图 3 Diatrypella quercina A 基质上的子囊座 B C 子囊束 D E 子囊 F G 子囊孢子 标尺 A 1000 m B C 50 m D G 20 m Fig3 Diatrypella quercina A Ascoma on the host surface B C Asci D E Ascus F G Ascospores Bars A 1000 m B C 50 m D G 20 m 10 图 4 Pleospora calvescens A 基质上的子囊座 B 子囊束 C D 子囊 E 未成熟的子囊 F G 子囊孢子 标尺 A 1000 m B 50 m C G 20 m Fig4 Pleospora calvescens A Ascoma on the host surface B Asci C D Ascus E Immature ascus F G Ascospores Bars A 1000 m B 50 m C G 20 m 11 图 5 Pleospora epilobii A 基质上的子囊座 B 子囊壳 C D 子囊 E 未成熟的子囊和子 囊孢子 F G 子囊孢子 标尺 A 1000 m B 100 m C G 20 m Fig5 Pleospora epilobii A Ascoma on the host surface B Perithecia C D Ascus E Immature ascus and ascospores F G Ascospores Bars A 1000 m B 100 m C G 20 m 12 2 3 1 Pleospora calvescens Fr ex Desm Tul C Tul Select fung carpol Paris 2 266 1863 图4 特征 子囊壳直径约 0 2mm 着生在子座的黑色部 顶部光滑无毛 边缘和 底部生有硬的深褐色的菌丝 子囊 100 128 10 14 m 圆筒形 内含孢子 8 个 子囊孢子 15 21 6 8 m 卵形 壁砖状分隔 有 3 个横向隔膜和 1 2 个纵向隔 膜 淡黄色 标本信息 采集地 青岛城阳棉花社区 采集时间 2010 07 18 采集人 于辉霞 2 3 2 Pleospora epilobii E M ll 1951 Sydowia 5 3 6 290 图5 特征 假子囊壳直径约 0 15mm 埋生于发达的子座内 外表层着生长的褐 色菌毛 子囊 82 124 11 14 m 圆筒形 内含 8 个子囊孢子 子囊孢子 18 23 7 9 m 卵形 砖格状分隔 黄色 标本信息 采集地 青岛城阳棉花社区 采集时间 2010 07 18 采集人 于辉霞 3 讨论 3 1 结论 在 5 个多月研究过程中共检查了 30 余份标本 共鉴定出 5 种腐生真菌 本 文主要对 5 种腐生真菌的形态进行了描述 并说明了采集地点及分布情况 3 2 存在问题 1 不能准确掌握显微境的使用方法 视野调整不清楚可能导致对真菌的重要 特征无法准确描述 2 分离真菌时 有时由于不仔细会漏掉一些小的子囊果 而且有时采用的操 作方法不恰当 挑取不到子囊果 3 由于保存的方法不完善 有时不成熟的真菌无法保存 最终导致细菌的增 长 没有得到想要的菌种 4 对于制作玻片的技术不到位 在显微镜下检查时 对于真菌的拍照有影响 出现重叠想象 有时会出现视野模糊 影响真菌的形态观察 在鉴定时候出现麻 13 烦 5 对真菌进行显微照相时 操作方法不到位或不准确 经常导致孢子大小测 量不准确或是照得的图片不清楚 6 实习的时间较短 在实验室里的真菌鉴定方面的书籍有限 给真菌的鉴定 带来很大的困难 只能借助部分书籍和网络鉴定 这其中必然存在一部分问题 3 3 心得 经过 5 个多月的实习 不仅提升了动手能力 还掌握了基本的实验技能 为以 后的进一步学习打下了坚实的基础 在这个过程中加深了对于腐生真菌的认识 同时进一步了解了真菌的特征 认识到真菌是一个极具潜力的领域 这段时间得 到的宝贵经验为以后的继续研究和深造提供了可能 14 致谢 本论文是在 教授的悉心指导下完成的 从论文的选题 设计 试验得热心 的帮助 路老师渊博的知识 敏锐的学术洞察力和踏实的工作精神 给我留实施 到最后的顺利完成 论文的撰写及修改 每一步都得到了导师的耐心指导和下了 深刻的印象 路老师宽广的知识