2012高中生物实验13DNA片段的PCR扩增辅导教案 浙科版

1 辅导教案辅导教案 导学诱思导学诱思 DAOXUEYOUSIDAOXUEYOUSI 一 PCR 技术 1 PCR 的全称是 2 PCR 技术是用于 DNA 片段复制 扩增的生化技术 3 PCR 技术用途 除用于基因扩增外 还用于 4 PCR 技术的具体应用 在法学 医学 食品和考古学上也是重要的实用工具 如 鉴定 鉴定 食品质量的确定 病诊断 肿瘤病和其他疾病的诊断以及 考古中人种的确定等 答案 答案 1 聚合酶链反应 3 测定 DNA 序列 4 亲子 犯罪 遗传 二 DNA 的体内自我复制与 PCR 技术 DNA 聚合酶在有 的存在时 利用 4 种 可从 末端向 末端 合成新链 PCR 技术还需要 作为 这一段叫 答案 答案 DNA 模板 脱氧核苷三磷酸 5 3 与 DNA 模板互补的一段单链 DNA 聚合 酶作用的起点 引物 三 PCR 作用的过程 1 1 个循环的操作 步骤具体操作 双链 DNA 将双链 DNA 加热至 DNA DNA 之间 的 打开 双链分离 也叫做 续表 步骤具体操作 与 结合双链分离后 将温度 这一降 2 温过程叫 退火后 引物可与 2 个 分别结合 DNA 新链的 下 聚合酶可利用 组装模板 的互补链 从引物延伸至 末端 2 一般大约需要重复上述 3 步骤 个循环 3 结果 一个循环形成 个双链 DNA 在 20 个循环后 大约 1h 1 个 DNA 片段可扩增 上百万个拷贝 30 个循环可产生 10 亿个拷贝 答案 答案 1 分开 95 变性 氢键 解链 引物 迅速降至 40 60 退火 单链的 DNA 模 板 延伸 72 4 种 dNTP 3 2 15 30 3 2 四 实验操作 1 设备 用品 略 2 材料 凝胶 DNA 标样 PCR 试剂盒 TBE 缓冲液 0 1 亚甲蓝 3 步骤 文字说明 取 3 个 0 5 mL 微量离心管 分别记做 1 2 3 号 用取样器按表一加入试剂 关闭上盖并 在振荡器上振荡 20 s 使之混合均匀 将 3 个微量离心管放在固定器上 保证每管中的液面在水浴中的水面以下 依表二的时间依 次放入 3 个水浴进行 PCR 将 TBE 缓冲液加入到电泳槽中 使缓冲液高出凝胶面 3 4 mm 再将样品加入凝胶板的加样孔中 所 加顺序内容依次为 凝胶板中的加样情况说明表凝胶板中的加样情况说明表 加样孔编号 对应右 图所示 1234 离心管中样品标号 SA1A2A3 所 加 样 品 1 号样品 20 微升 DNA 标 准溶液 PCR 产物 1 72 1min 后 得到的 PCR 产物 2 72 1min 70 2min 后得到 对照组产物 3 的 2 号样品 2 微升 蓝色缓冲液 1 号样品与 2 号样品必须充分混匀后再加入 开始进行电泳 若用 18 V 电池的电泳 4 6 h 若甲直流电泳仪电源 80 V 可电泳 40 min 电泳后将凝胶缓冲液倒出 缓冲液可再利用 将 10 mL 染色剂 亚甲蓝 覆盖在凝胶表面 15 20 min 后移去 可再利用 再加入 5 mL70 乙醇 不断摇动 1 2 min 使其分布均 匀 再除去 加入冷水 几分钟后看到蓝色的区带出现 这就是扩增的 DNA 比较 判断胶片结果 图表辅助 表一 试剂1 号管 12 个循环 2 号管 14 个循环 3 号管 对照 PCR 混 合液 2020 蒸馏 水 20 引物 202020 模板 DNA 101010 总体 积 505050 4 表二 时间温度目的 2 min 30 s 30 s 1 min 2 min 95 95 49 72 70 开始变性 解链 最后扩增 5 胶片染色结果 核心解读核心解读 HEXINJIEDUHEXINJIEDU 1 为什么 DNA 复制需要引物 DNA 的两条链是反向平行的 为了明确地表示 DNA 的方向 通常将 DNA 的羟基末端称为 3 端 而磷酸基团的末端称为 5 端 DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA 而只能从 3 端 延伸 DNA 链 因此 DNA 复制需要引物 当引物与 DNA 母链通过碱基互补配对结合后 DNA 聚合酶就能从引物的 3 端开始延伸 DNA 链 DNA 的合成方向总是从子链的 5 端向 3 端延 伸 DNA 复制方向的示意图 2 细胞内参与 DNA 复制的各种组成成分和作用是怎样的 参与的组 分 在 DNA 复制中的作用 解旋酶打开 DNA 双链 DNA 母链提供 DNA 复制的模板 4 种脱氧核 苷酸 合成子链的原料 DNA 聚合酶催化合成 DNA 子链 6 引物 使 DNA 聚合酶能够从引物的 3 端开始连接脱 氧核苷酸 3 细胞内的 DNA 复制与体外 DNA 扩增 PCR 技术 相同吗 两者又有什么关联呢 细胞内的 DNA 复制与体外 DNA 扩增 PCR 技术 是不同的 两者具体比较见下表 细胞内 DNA 复制 PCR 解旋有解旋酶的参与 边解旋边复制80 100 高度解旋 双链完全分开 酶DNA 解旋酶 DNA 聚合酶 DNA 连接酶TaqDNA 聚合酶 引物 RNA DNA 或 RNA 能量 ATP 不加 不 同 点 温度体内温和条件高温 相同 点 提供 DNA 复制的模板 四种脱氧核苷酸作原料 子链延伸的方向都是从 5 端到 3 端 PCR 反应是通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行 PCR 反应的实质就是 DNA 复制 所以有关 PCR 反应的题目与 DNA 复制的原理相同 计算方法也大体相同 例如 PCR 反应中 的目的片段一般以 2n的方式积累 其中 n 为反应循环次数 一个 DNA 片段在 30 次循环后反 应物中大约有 10 亿 230 个这样的片段 4 当 PCR 反应体系的温度经快速冷却到 50 左右时 为什么一般不考虑解开的 2 个 DNA 模板链又重新结合了 这是为什么 原因是 1 模板 DNA 比引物长得多 复杂得多 不易重新结合 2 引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞 3 加入的引物的量足够大而模板链数量少 模板链浓度低 不易结合 5 为什么 PCR 能有广泛用途 除用于 DNA 扩增外 还有哪些用途 在生物基因组中存在着许多差异 如物种之间的差异 基因表达上的时间差异 基因表 达的地域或组织差异 变异后的差异 生理和病理变化引起的差异 遗传的差异 杂交的差 异等 但这些差异只有在 DNA 扩增后才能被观察出来 因此 PCR 是这种差异的一种观察方 法 因而在法医学上 在遗传病和其他疾病的诊断 考古中人种的确定 食品质量的确定上 和基因转移上都可使用 6 PCR 的反应过程具体是怎样的 7 PCR 一般要经历三十多次循环 每次循环可以分为变性 当温度上升到 90 以上时 双 链 DNA 解聚为单链 复性 温度下降到 50 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合 和延伸 温度上升到 72 左右 溶液中的四种脱氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的 DNA 链 三步 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作 为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的 DNA 单链会与引物 结合 进行 DNA 的延伸 这 样 DNA 聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的 DNA 序列 使这段固定长度的序列成指 数扩增 第一轮的产物作为第二轮的模板 经过变性 复性 延伸三步 第二轮的产物作为第三轮的模板 经过变性 复性 延伸三步 8 题例领悟题例领悟 TILILINGWUTILILINGWU 例题 1 一个由 15N 标记的 DNA 分子 放在没有标记的环境中培养 利用 PCR 循环 5 次后标记的 DNA 分子占总数的 A 1 10 B 1 5 C 1 16 D 1 25 解析 解析 一个 DNA 分子利用 PCR 技术循环 5 次后产生的 DNA 分子数目为 2n 而 DNA 的复制 是半保留复制 其特点是新形成的 DNA 双链 一条是来自亲代 DNA 分子的母链 另一条是新 形成的子链 这样最初由 15N 标记的 DNA 分子复制后 其标记的两条链就分别进入两个子代 DNA 分子中 这样两个子代 DNA 分子被标记了 以后均是在没有标记的环境中培养 不论经 过多少次复制 最初标记的两条链始终存在于两个 DNA 分子中 这样经过 n 次循环后 标记 的 DNA 分子中的 2 2n 即 1 2n 1 答案 C PCR 技术的实质就是 DNA 分子的复制 例题 2 DNA 的复制需要引物 其主要原因是 A 可加快 DNA 的复制速度 B 引物可与 DNA 母链通过碱基互补配对结合 C 引物的 5 端有助于 DNA 聚合酶的延伸 DNA 链 D DNA 聚合酶只能从 3 端延伸 DNA 链 解析 解析 DNA 的两条链是反向平行的 为了明确地表示 DNA 的方向 通常将 DNA 的羟基 OH 末端称为 3 端 而磷酸基团的末端称为 5 端 DNA 聚合酶不能从 5 端开始合成 DNA 9 而只能从 3 端延伸 DNA 链 因此 DNA 复制需要引物 当引物与 DNA 母链通过碱基互补配 对结合后 DNA 聚合酶就能从引物的 3 端开始延伸 DNA 链 DNA 的合成方向总是从子链的 5 端向 3 端延伸 答案 D DNA 复制是有方向的 只能由 3 端延伸至 5 端 而不能倒过来 随堂训练随堂训练 SUITANGXUNLIANSUITANGXUNLIAN 11 个 PCR 循环后 一个由 15N 标记的 DNA 分子 放在没有标记的环境中培养 可产生几 个含 15N 标记的 DNA 分子 A 1 个 B 23 8 个 C 2 个 D 4 个 答案 答案 C 解析 解析 PCR 的 1 次循环 相当于 1 个 DNA 分子复制了 1 次 因为 DNA 的复制为 半保留复制 所以形成了 2 个带标记的