2005年植物生理学实验总结

实验实验 1 1 叶绿体色素的提取 分离叶绿体色素的提取 分离 教学目标与基本要求 1 了解叶绿体色素的提取方法 2 学习叶绿体色素的纸层析分离方法 实验内容或指导思想 1 以有机溶剂提取 2 准备滤纸条并点样 3 将滤纸条固定在有展层剂的试管中 4 观察分 离结果 一 原理 叶绿体中含有绿色素 包括叶绿素 a 和叶绿素 b 和黄色素 包括胡萝卜素和叶黄素 两大类 它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体 这两类色素都不溶于水 而溶于有机溶剂 故可用乙 醇 丙酮等有机溶剂提取 提取液可用色谱分析的原理加以分离 因吸附剂对不同物质的吸附力不 同 当用适当的溶剂推动时 混合物中各种成分在两相 固定相和流动相 间具有不同的分配系数 所以移动速度不同 经过一定时间后 可将各种色素分开 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 菠菜 小白菜叶片 二 仪器设备 1 研钵 2 漏斗 3 三角瓶 4 剪刀 5 滴管 6 培养皿 直径 11cm 7 康维皿或平底短玻管 8 圆形滤纸 直径 11cm 三 试剂 1 95 乙醇 2 石英砂 3 碳酸钙粉 4 推动剂 按石油醚 丙酮 苯 10 2 1 比例配制 V V 三 实验步骤 1 叶绿体色素的提取 1 取菠菜或其他植物新鲜叶片 4 5 片 2g 左右 洗净 擦干 去 掉中脉剪碎 放入研钵中 2 研钵中加 2 3ml95 乙醇 研磨至糊状 再加 10 15ml95 乙醇 提取 35min 上清液过滤于三角瓶中 残渣用 10ml95 乙醇冲洗 一同滤于三角瓶中 3 如无 新鲜叶片 也可用事先制好的叶干粉提取 取新鲜叶片 以菠菜叶最好 先用 105 杀青 再在 80 下烘干 研成粉末 密闭贮存 用时称叶粉 2g 放入小烧杯中 加 95 乙醇 20 30ml 浸提 并随时搅动 待乙醇呈深绿色时 滤出浸提液备用 2 叶绿体色素的分离 1 取圆形定性滤纸一张 直径 11cm 在其中心戳一圆形小孔 直径约 3mm 另取一张滤纸条 5cm 1 5cm 用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度 方向涂在纸条的一边 使色素扩散的宽度限制在 0 5cm 以内 风干后 再重复操作数次 然后沿长 度方向卷成纸捻 使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端 2 将纸捻带有色素的一端插 入圆形滤纸的小孔中 使与滤纸刚刚平齐 勿突出 3 在培养皿内放一康维皿 在康维皿中 央小室中加入适量的推动剂 把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上 使纸捻下端浸入推动剂中 迅速盖好培养皿 此时 推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上 并把叶绿体色素向四周推 动 不久即可看到各种色素的同心圆环 如无康维皿 也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药 瓶盖 以盛装推动剂 所用培养皿底 盖直径应相同 且应略小于滤纸直径 以便将滤纸架在培养 皿边缘上 4 当推动剂前沿接近滤纸边缘时 取出滤纸 风干 即可看到分离的各种色素 叶 绿素 a 为蓝绿色 叶绿素 b 为黄绿色 叶黄素为鲜黄色 胡萝卜素为橙黄色 用铅笔标出各种色素 的位置和名称 叶绿素含量的测定叶绿素含量的测定 一 原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收 利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度 即 可用公式计算出提取液中各色素的含量 根据朗伯 比尔定律 某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质 浓度 C 和液层厚度 L 成正比 即 A CL 式中 比例常数 当溶液浓度以百分浓度为单位 液 层厚度为 1cm 时 为该物质的吸光系数 各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测 定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得 如果溶液中有数种吸光物质 则此混合液在某 一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和 这就是吸光度的加和性 今欲测定叶 绿体色素混合提取液中叶绿素 a b 和类胡萝卜素的含量 只需测定该提取液在三个特定波长下的 吸光度 A 并根据叶绿素 a b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度 在测定叶绿 素 a b 时为了排除类胡萝卜素的干扰 所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 新鲜 或烘干 的植物叶片 二 仪器设备 1 分光光度计 2 电子顶载天平 感量 0 01g 3 研钵 4 棕色容量 瓶 5 小漏斗 6 定量滤纸 7 吸水纸 8 擦境纸 9 滴管 三 试剂 96 乙醇 或 80 丙酮 石英砂 碳酸钙粉 三 实验步骤 1 取新鲜植物叶片 或其它绿色组织 或干材料 擦净组织表面污物 剪碎 去掉中脉 混匀 2 称取剪碎的新鲜样品 0 2g 共 3 份 分别放入研钵中 加少量石英砂和碳酸钙粉及 2 3ml95 乙醇 研成均浆 再加乙醇 10ml 继续研磨至组织变白 静置 3 5min 3 取滤纸 1 张 置漏斗中 用乙醇湿润 沿玻棒把提取液倒入漏斗中 过滤到 25ml 棕色容量瓶中 用少量乙 醇冲洗研钵 研棒及残渣数次 最后连同残渣一起倒入漏斗中 4 用滴管吸取乙醇 将滤纸上的 叶绿体色素全部洗入容量瓶中 直至滤纸和残渣中无绿色为止 最后用乙醇定容至 25ml 摇匀 5 把叶绿体色素提取液倒入光径 1cm 的比色杯内 以 95 乙醇为空白 在波长 665nm 649nm 下测定 吸光度 四 实验结果计算 将测定得到的吸光值代入下面的式子 Ca 13 95A665 6 88A649 Cb 24 96A649 7 32A665 据此即可得到叶绿素 a 和叶绿素 b 的浓度 Ca Cb mg L 二者之和为总叶绿素的浓度 最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的 含量 叶绿素的含量 mg g 叶绿素的浓度 提取液体积 稀释倍数 样品鲜重 或干重 实验实验 2 2 测定植物的呼吸速率 小篮子法 广口瓶法 测定植物的呼吸速率 小篮子法 广口瓶法 教学目标与基本要求 1 学习呼吸强度的碱吸收测定方法 2 比较不同类型植物材料的呼吸强度 3 了解环境 因素 如温度 对呼吸强度的影响 实验内容或指导思想 一 原理 植物进行呼吸时放出 CO2 计算一定的植物样品在单位时间内放出 CO2的数量 即为该样品的 呼吸速率 呼吸放出的 CO2可用氢氧化钡溶液吸收 实验结束后用已知浓度的草酸溶液滴定剩余的 碱液 从空白和样品二者消耗草酸溶液之差即可计算出呼吸过程中释放的 CO2的量 二 材料 设备仪器及试剂 一 材料 发芽的小麦种子或其它萌发的种子 二 仪器设备 1 呼吸测定装置 2 天平 3 钟表 4 酸式及碱式滴定管 5 温度计 三 试剂 1 0 05mol L 左右的 Ba OH 2 称取 Ba OH 2 8 6g 溶于 1000ml 蒸馏水中 2 1 44mol L 草酸溶液 准确称取重结晶的 H2C2O4 2H2O 2 8651g 溶于蒸馏水中定容至 1000ml 每 ml 相当于 1mgCO2 3 酚酞指示剂 1g 酚酞溶于 100ml 95 乙醇中 贮于滴瓶中 三 实验步骤 1 取 500ml 广口瓶一个 瓶口瓶用打有三孔的橡皮塞塞紧 一孔插一盛碱石灰的干燥管 使 呼吸过程中能进入无 CO2的空气 一孔插温度计 另一孔直径约 1cm 供滴定用 平时用一小橡皮 塞塞紧 瓶塞下面挂一铁丝纱小篮 以便装植物样品 整个装置即谓 广口瓶呼吸测定装置 2 在瓶口准确加入约 0 05mol L 的 Ba OH 2溶液 20ml 立即塞紧橡皮塞 不带小篮 充分 摇动广口瓶 2min 待瓶内 CO2全部被吸收后 拔出小橡皮管塞 加入酚酞指示剂 2 滴 把滴定管插 入孔中 用标准草酸溶液进行空白滴定 直到红色刚刚消失为止 3 倒出废液 用无 CO2的蒸馏水 煮沸过的 洗净后 重加上述 Ba OH 2溶液 20ml 同时 称取植物样品 5 10g 装入小篮子中 挂于橡皮塞下 塞紧瓶塞 开始记录时间 经过 20 30min 其间轻轻摇动数次 使溶液表面的 BaCO3薄膜破坏 有利于充分吸收 CO2 然后用草酸 滴定 方法如前 注意 防止口中呼出的气体浸入瓶内 四 结果计算 呼吸速率 mgCO2 g FW h A B 1 W t 上式中 A 空白滴定用去的草酸量 ml B 样品滴定用去的草酸量 ml W 样品鲜重 g t 测定时间 h 每毫升 1 44mol L 的草酸相当于 1mgCO2 1 学习呼吸强度的碱吸收测定方法 2 比较不同类型植物材料的呼吸强度 3 了解环境 因素 如温度 对呼吸强度的影响 1 将植物材料放入一容器中 容器应能保证氧气供应但不允许 CO2进入或漏出 容器底 部加入碱溶液 该溶液不应与植物材料接触 2 1 小时后打开容器 迅速向碱液中加入指示剂 然后以酸溶液滴定 记录酸溶液消耗量 3 以沸水煮死的材料作同样测定 此为对照 4 计算 材料呼吸强度 实验实验 3 3 植物组织水势的测定 小液流法 植物组织水势的测定 小液流法 教学目标与基本要求 1 学习以小液流法测定植物组织水势的方法 2 运用所学方法测定不同生态环境下植物组织的水势 实验内容及指导思想 1 配制浓度梯度蔗糖溶液并将各浓度溶液分为试验组和对照组 2 将植物材料置试验组溶液中30min 并在其中加入甲烯蓝粉末少许 震荡均匀 3 以弯头滴管取蓝色溶液置于相应浓度对照组试管中部 轻轻挤出 观察蓝色液流动向 4 计算 一 原理 将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中 当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保 持动态平衡时 则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势 因溶液的浓度是已知的 可以根据 公式算出其渗透压 取其负值 为溶液的渗透势 即代表植物的水势 w waterpotential w P CRT 大气压 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 小白菜或其它作物叶片 二 仪器设备 1 带塞青霉素小瓶 12 个 2 带有橡皮管的注射针头 3 镊子 4 打孔器 5 培养皿 三 试剂 1 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 30mol L 蔗糖溶液 2 甲烯蓝粉末 三 实验步骤 一 取干燥洁净的青霉素瓶 6 个为甲组 各瓶中分别加入 0 05 0 30mol L 蔗糖溶液约 4ml 约为青霉素瓶的 2 3 处 另取 6 个干燥洁净的青霉素瓶为乙组 各瓶中分别加入 0 05 0 30mol L 蔗糖溶液 1ml 和微量甲烯蓝粉末着色 上述各瓶加标签注明浓度 二 取待测 样品的功能叶数片 用打孔器打取小圆片约 50 片 放至培养皿中 混合均匀 用镊子分别夹入 5 8 个小圆片到盛有不同浓度的甲烯蓝蔗糖溶液的青霉素瓶中 乙组 盖上瓶塞 并使叶圆片 全部浸没于溶液中 放置约 30 60min 为加速水分平衡 应经常摇动小瓶 三 经一定时间后 用注射针头吸取乙组各瓶蓝色糖液少许 将针头插入对应浓度甲组青霉素瓶溶液中部 小心地放出 少量液流 观察蓝色液流的升降动向 每次测定均要用待测浓度的甲烯蓝蔗糖溶液清洗几次注射 针头 如此方法检查各瓶中液流的升降动向 若液流上升 说明浸过小圆片的蔗糖溶液浓度变小 即植物组织失水 表明叶片组织的水势高于该浓度糖溶液的渗透势 如果蓝色液流下降则说明 叶片组织的水势低于该糖溶液的渗透势 若蓝色液流静止不动 则说明叶片组织的水势等于该糖溶 液的渗透势 此糖溶液的浓度即为叶片组织的等渗浓度 四 结果计算 将求得的等渗浓度值代入如下公式 w CRTi 1 013 0 1 式中 w 植物组织的水势 单位 Mpa 溶液的 渗透势 C 等渗浓度 mol L R 气体常数 0 008314MPa L mol K T 绝对温度 i 解离系数 蔗糖 1 CaCl2 2 60 1 大气压 1 013 0 1MPa 实验实验 4 4 气孔状态的观察 印迹法 固定法 气孔密度的测定气孔状态的观察 印迹法 固定法 气孔密度的测定 钾离子对气孔开度的影响钾离子对气孔开度的影响 教学目标与基本要求 1 研究K 和N a 对气孔开度的影响 2 了解K 在气孔运动中的作用及其与光照的关系 实验内容或指导思想 1 配制KNO3和NaNO3溶液 2 各溶液置于培养皿中并将蚕豆 叶表皮放入各培养皿 以 蒸馏水为对照 3 控制温度和光照 4 观察气孔开放情况 气孔保卫细胞内钾离子变化观察气孔保卫细胞内钾离子变化观察 教学目标与基本要求 1 观察气孔运动与保卫细胞中K 浓度变化的关系 2 了解K 在气孔运动中的作用 实验内容或指导思想 1 材料培养并作光 暗处理 2 撕取叶表皮并以亚硝酸钴钠染色 3 样品固定并观察 小孔的扩散 示范 原 理 气孔蒸腾是植物散失水分的主要途径 气孔口很小 其总面积一般不超过叶面积的 1 可是叶子通过气孔蒸腾所损失的水分却达到与叶面积相等的自由表面的 50 80 如此惊人的 蒸腾量 可以用小孔扩散原理加以说明 水分通过小孔扩散的量和小孔的周缘长度成正比 而 和小孔面积不成比例 通过此试验所产生的现象 可以证明小孔边缘效应的存在 仪器获品 小烧杯 台天平 培养皿 刀片 尺及解剖针 卡片纸 1 琼脂 石蜡 红墨水或蓝墨水 酒糟或丙酮 操作步骤 1 物质通过小孔扩散的途径 预备聚乙烯塑料薄膜 可用食品袋 一张 大小约 5 5cm 取解剖针于煤气灯上加热 在薄膜中央穿刺一小孔 配制 1 琼脂 倒在一小烧坏中 如用 10ml 小烧杯 则更易于观察 待琼脂还未完全凝固时 将薄膜小心地贴在琼脂的表面 使小孔位于烧杯的中央 等琼脂凝固 后 在薄膜上面倒上有色溶液少许 4 5 小时后 即可看到有色溶液通过小孔向琼脂凝胶中 扩散 形成一个有色的半球形 它显示染料通过小孔扩散的途径 2 将卡片纸剪成与培养皿大小一致的圆片 然后在一张卡片纸的中部剪成一正方形大孔 每 边长3cm 则面积为9cm2 在另一卡片纸上剪成数个小孔 其总面积与大孔完全相等 为此 将其剪成 9个每边长1cm的正方形小孔 并使其均匀地分布在圆形卡片纸上 再将此卡片纸浸 于熔化的石蜡中 取出盖于培养皿上 并用石蜡将边缘封严 于两皿中各加入等量的酒精 或 丙酮 将此皿分别置于台天平两边用酒精调节使之平衡 隔15 30分钟后 由于小孔具有较 高的边缘效应 酒精蒸发较快 因此台天平指针倾向大孔一边 由此可看出孔的总面积虽相等 但酒精通过小孔的散失比大孔要快得多 证明小孔的边缘效应要大 因其周缘长度比大孔大 教材与教学 初中 初中生物 实验区风采 辽宁 新教材实验探索二则大连海事大学附校 李 薇 1 观察气孔的简易方法观察气孔的简易方法 在进行叶片结构的观察时 观察气孔是一项不可缺少的项目 因为气孔是植物蒸腾失水的 门户 也是气体交换的窗口 正确理解气孔的结构和工作原理是十分必要的 但是通过制作叶 片的临时切片观察气孔 很难达到预期的效果 我们曾做过各种各样的尝试 甚至用面膜 丙 酮的乒乓球溶液也只能观察到气孔的影印 无法展现气孔工作的真实情况 如果观察不到气孔 就很难正确理解教学内容 无法达到教学目的 采用洋葱为材料来观察气孔的方法似乎更简易 效果也不错 不妨试一试 在观察植物细胞时用到的洋葱不妨多买几颗 实验完成之后把剩余的洋葱放在加水的培养 皿中培养 两天换一次水 放在实验室中向阳的地方 几天之后洋葱就会发出新叶 这时要坚 持每天换水 过 l 2 个月洋葱叶茂时正值 观察叶片结构 的教学 选择阳光晴好的时间实 验 剪取一小段叶片 满加少许水 叶片肥厚不加水也可 以润湿为宜 制成临时切片 放在 显微镜下观察 调节好光线 强光下 就能观察到气孔 而且刚取下的叶片气孔正在一张一合 镜下仿佛无数只绿色的眼睛在眨 与气孔在电子显微镜下的照片一模一样 真可以说是用普通 的光学显微镜取得了电子显微镜的效果 这种方法非常简便 不需要严格的制片技术 只需培养洋葱即可 而且一个班级四 五十 人只要 1 颗洋葱就可以 完全可以把洋葱交给学生培养 放在教室的窗台上 也会使寒冬充满 生机 2 观察发酵现象的演示实验的新方法观察发酵现象的演示实验的新方法 原理 葡萄糖发酵产生 CO2 CO2气体产生的压力将推动红色液柱移动直至排出 材料 125 mL 广口瓶 温度计 2 支 自制多组 U 形管 如下图 小烧杯 水浴锅 药匙 玻璃棒 红墨水 方法步骤 l 实验前将器材准备好 橡胶塞打孔 广口瓶置于 40 45 的水浴锅中 2 U 形管中注入 5 cm 高度的红墨水 如图中位置 温度计与 U 形管插入到橡胶塞中 温度计水银球置于广口瓶中部 广口瓶中的 U 形管口距液面保持一定距离 防止反应发生时 产生的物质阻塞管口 3 广口瓶中加入适量水 保持广口瓶及连带装置在水浴锅中稳定直立 加入一勺糖搅拌 融化 一切准备就绪之后 在广口瓶中倒入适量酵母 快速搅拌后加盖橡胶塞 注意密封 4 用彩笔记录初始状态下的红色液柱位置 U 形管口另一端接一盛清水的小烧杯 5 随着发酵反应的进行 CO2气体产生 U 形管中红色液柱缓缓移动 直至排出 烧杯 中的水变红 6 若想检验产生的气体为 CO2 可在红色液柱排净后将产生的气体通入事先制备好的澄 清的石灰水中 也可以观察是否能使燃着的火柴熄灭 分析 生物学是一门以实验为基础的学科 实验教学在课堂教学中占有极其重要的地位 课堂演示实验是结合教学内容的需要 用演示的方法进行的实验教学 是一种直观的教学手段 课堂演示实验应尽可能在一个单位的教学时间内完成 尽可能让学生观察到实验的全过程 以 加深学生对问题的理解 教材上 观察发酵现象的演示实验 所需时间长 至少要 l 2 d 才能 观察到气球鼓起 在学生课下进行自主实验的基础上 课堂上采取这种方法进行演示实验可使 学生在几分钟内观察到实验现象 而且反应的时间还可通过控制酵母的量和温度来调节 更具 有说服力 并且还能直接对产生的气体进行检验 由于实验需要控制温度条件 学生对发酵以 及酵母菌生活的适宜温度的理解会更加深刻 注 此反应必须在 40 45 的恒温水浴锅中进行 否则反应进行慢而且初始 时会因温度下降导致红色液柱向广口瓶中回流 装置如下图示 实验实验 5 5 硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶活性的测定 教学目标与基本要求 1 掌握硝酸还原酶活性测定方法 2 比较不同植物的酶活性 实验内容或指导思想 1 绘制NO2 标准曲线 2 取新鲜植物材料置入含有NO 3 的缓冲液中保温30min 3 取反应液 显色并与标准曲线比较以求出NO2 产生量 4 计算酶活性 硝酸还原酶活性的测定 原理 硝酸还原酸是植物氮素代谢作用中关键性酶 与作物吸收各利用氮肥有关 它作用于 NO 3使其还原为 NO 2 NO 3 NADH H NO 2 NAD H2O 产生的 NO 2可以从级织内渗透到外界溶液中 并积累在溶液中 测定反应溶液中 NO 2含 量的增加 即表现该酶活性的大小 这种方法简单易行 在一般条件下都能做到 NO 2含量的测定用磺胺 对氨基苯磺酸胺 sulfanil amide 比色法 在酸性溶液中磺胺与 NO 2形成重氮盐 再与 萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料 反应液的酸度大则增加重氮化作 用的速度 但降低偶联作用的速度 颜色比较稳定 增加温度可以增加反应速度 但降低重氮 盐的稳定度 所以反应需要在相同条件下进行 这种方法非常灵敏 能测定每 ml 含 0 5 g 的 NaNO2 仪器药品 721 型分光光度计 真空泵 或注射器 保温箱 天平 真空干燥器 钻孔器 三角烧瓶 移液管 烧杯 0 1mol L 磷酸缓冲液 pH7 5 见附表 2 0 2mol L KNO3 溶解 20 22gKNO3于 1 000ml 蒸馏水中 磺胺试剂 1g 磺胺加 25ml 浓盐酸 用蒸馏水稀释至 100ml 萘胺试剂 0 2g 萘胺溶于含 1ml 浓盐酸的蒸馏水中 稀释至 100ml NaNO2标准溶液 1g NaNO2用蒸馏水溶角成 1 000ml 然后吸取 5ml 再加蒸馏水稀释成 1 000ml 此溶液每 ml 含有 NaNO2 10 g 用时稀释之 操作步骤 1 将新鲜取回的叶片 将新鲜取回的叶片 蓖麻 烟草 向日葵 油菜 小麦 棉花等均可 水先 用吸水纸吸 干 然后用钻孔器钻成直径约 1cm 的圆片 用蒸馏水洗涤 2 3 次 吸干水分 然后于台天平 上称取等重的叶子圆片两份 每份约 0 3 0 4g 或每份取 50 个圆片 分别置于含有下列溶 液的 50ml 三角烧瓶中 1 0 1mol L 磷酸缓冲溶液 pH7 5 5ml 蒸馏水 5ml 2 0 1mol L 磷酸缓冲溶液 pH7 5 5ml 0 2mol L KNO3 5ml 然后将三角烧瓶置于真空干燥器中 接上真空泵抽气 放气后 圆片即沉于溶液中 如果没有真空泵 也可以用 20ml 注射器代替 将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中 用手指堵住注射器出口小孔 然后用力拉注射器使真 空 如此抽气放气反复进行多次 即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中 将三角烧瓶置于 30 温箱中 使不见光 保温作用 30 分钟 然后分别吸取反应溶液 1ml 以测定 NO 2含量 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用 以积累碳水化合物 如果组织中的碳水化合 物含量低 会使得酶的活性降低 此时则可于反应溶液中加入 30 g 3 磷酸甘油醛或 1 6 二 磷酸果糖 能显著增加 NO 2的产生 2 NO 2含量的测定含量的测定 保温 30 分钟的结束时 吸取反应溶液 1ml 于一试管中 加入磺胺试剂 2ml 及 萘胺试 剂 2ml 混合摇匀 静置 30 分钟 用比色计进行比色测定 比色波长为 520nm 记下吸光度 或透光率 从标准曲线上查得 NO 2含量 然后计算酶活性 以每小时每克鲜重产生的 NO 2 g 或 mol 表示之 3 绘制标准曲线 绘制标准曲线 测定 NO 2 的磺胺比色法很灵敏 可以检出低于 1 g ml 的 NaNO2含量 可于 0 5 g ml 浓度范围内绘制标准曲线 由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关 温度 酸浓度等都影响显色速度 同时也影响灵敏度 但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行 则显色速度相同 彼此可以比较 吸取不同浓度的NaNO2溶液 例如5 4 3 2 1 0 5 g ml 1ml于试管中 加入磺胺 试剂2ml及 萘胺试剂2ml 混合摇匀 静置303分钟 或于一定温度的水浴中保温30分 钟 立即于分光光度计中进行测定 测定时的波长为520nm 比色 读取吸光度或透光 率 然后 以吸光度为纵坐标 NaNO2浓度为横坐标 于毫米方格纸上绘制吸光度 浓度 曲线 实验实验 6 6 植物种子生命力的快速测定植物种子生命力的快速测定 TTC 法 一 原理 TTC 2 3 5 三苯基氯化四氮唑 的氧化态是无色的 可被氢还原成不溶性的红色三苯 甲月替 TTF 应用 TTC 的水溶液浸泡种子 使之渗入种胚的细胞内 如果种胚具有生命力 其中的脱氢酶就可以将 TTC 作为受氢体使之还原成为三苯甲月替而呈红色 如果种胚死亡便不 能染色 种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色 因此 可以根据种胚染 色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 水稻 小麦 玉米 棉花 油菜等待测种子 二 仪器设备 1 小烧杯 2 刀片 3 镊子 4 温箱 三 试剂 0 12 0 5 TTC 溶液 TTC 可直接溶于水 溶于水后 呈中性 pH7 0 5 不宜久藏 应随用随配 三 实验步骤 1 将种子用温水 约 30 浸泡 2 6h 使种子充分吸胀 2 随机取种子 100 粒 水稻种子要去壳 豆类种子要去皮 然后沿种胚中央准确切开 取 其一半备用 3 将准备好的种子浸于 TTC 试剂中 于恒温箱 30 35 中保温 30min 4 染色结束后要立即进行鉴定 因放久会褪色 倒出 TTC 溶液 再用清水将种子冲洗 1 2 次 观察种胚被染色的情况 凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生命力的种子 种胚不被染色的为死种子 如果种胚中非关键性部位 如子叶的一部分 被染色 而胚根或胚 芽的尖端不染色都属于不能正常发芽的种子 染料染色法 原理 有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性 有选择吸收外界物质的能力 一般染料不能 进入细胞内 胚部不染色 而丧失生命力的种子 其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力 染料可自由进入细胞内使胚部染色 所以可根据种子胚部是否被染色来判断种子的生命力 二 材料 设备及试剂 一 材料 水稻 玉米 大豆 棉花 小麦及一些树木种子 二 设备 1 小烧杯 2 刀片 3 镊子 三 试剂 0 02 0 2 靛红溶液或 5 红墨水 酸性大红 G 三 实验步骤同 TTC 法 荧光法 一 原理 植物种子中常含有一些能够在紫外线照射下产生荧光的物质如某些黄酮类 香豆素类 酚 类物质等 在种子衰老过程中 这些荧光物质的结构和成分往往发生变化 因而荧光的颜色也 相应地有所改变 而且这些种子在衰老死亡时 内含荧光物质虽然没有改变 但由于生命力衰 退或已经死亡的细胞原生质之透性增加 当浸泡种子时 细胞内的荧光物质很容易外渗 因此 可以根据前一种情况直接观察种胚荧光的方法来鉴定种子的生命力 或根据后一种情况通过观 察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生命力 二 材料及设备 1 待测的植物种子 2 紫外光灯 3 白纸 不产生荧光的 4 刀子 5 镊子 6 培养皿 7 烧杯 三 实验步骤 1 直接观察法 这种方法适用于禾谷类 松柏类及某些蔷薇科果树的种子生命力的鉴定 但种间的差异较大 用刀片沿种子的中心线将种子切为两半 使其切面向上放在无荧光的白纸 上 置于紫外光灯下照射并进行观察 记载 有生命力的种子在紫外光的照射下将产生明亮的 蓝色 蓝紫色或蓝绿色的荧光 丧失生命力的死种子在紫外光照射下多呈黄色 褐色以至暗淡 无光 并带有多种斑点 随机选取 20 粒待测种子按上述方法进行观察并记载有生命力及丧失生 命力的种子的数目 然后计算有生命力种子所占百分数 与此同时也作一平行的常规发芽试验 计算其发芽率作为对照 2 纸上荧光 随机选取 50 粒完整无损的种子置烧杯内加蒸馏水浸泡 10 15min 令种子吸 胀 然后将种子沥干 再按 0 5cm 的距离摆放在湿滤纸上 滤纸上水分不宜过多 防止荧光物 质流散 以培养皿覆盖静置数 h 后将滤纸 或连同上面摆放的种子 风干 或用电吹风吹干 置紫外光灯下照射 可以看到摆过死种子的周围有一圈明亮的荧光团 而具有生命力的种子周 围则无此现象 根据滤纸上显现的荧光团的数目就可以测出丧失生命力的种子的数量 并由此 计算出有生命力种子所占的百分率 此外 可与此同时作一平行的常规种子萌发试验计算其发 芽率作为对照 这个方法应用于白菜 萝卜等十字花科植物种子生命力的鉴定上效果很好 但 对于一些在衰老 死亡后减弱或失去荧光的种子便不适用此法 因此 对它们只宜采用直接察 法 实验实验 7 7 类似生长素对种子萌发的影响类似生长素对种子萌发的影响 一 原理 生长素及人工合成的类似物质如萘乙酸等对植物生长有很大的调节作用 在不同浓度下对植物生长的效应也不同 一般来说 低浓度的生长素促进生长 高浓度时则抑制生长 不同的植物器官对生长素的反应也不同 通常根比芽 茎对生长素更敏感 本实验据此观察不同浓度的萘乙酸在种子萌发过程中对植 物不同器官生长的影响 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 小麦种子 二 仪器设备 温箱 培养皿 移液管 镊子 滤纸 尺子 三 试剂 10mg L 萘乙酸 0 1 升汞 三 实验步骤 1 取小麦种子 用 0 1 升汞消毒 15min 再用自来水和蒸馏水各冲洗 3 次 置于 22 的温箱中催芽 2d 2 取 9cm 的洁净培养皿 7 套 编号 在 1 号培养皿中加入 10mg L 萘乙酸 10mL 然后从其中吸取 1mL 放入 2 号培养皿中 加 9mL 蒸馏水混匀后即成为 1 mg L 萘乙酸溶液 如此依次稀释到 6 号培养皿 最后从第 6 号培养皿中取出 1mL 弃去 则 1 号至 6 号培养皿中的萘乙酸浓度依次为 10 mg L 1 mg L 0 1 mg L 0 01 mg L 0 001 mg L 0 0001 mg L 第 7 号培养皿中则 加入 9mL 蒸馏水作为对照 3 在各培养皿中放入一张与培养皿皿底大小一致的滤纸 选取已萌动的小 麦种子 10 粒 用镊子将其整齐地排列在培养皿中 使芽尖朝上并使胚的部位朝 向同一侧 盖上皿盖后 放在 22 的温箱中暗培养 3d 4 测量培养皿内小麦幼芽及幼根的平均长度以及根的数目 四 实验结果计算与分析 以蒸馏水中的材料为对照 计算不同浓度萘乙酸溶液中小麦幼芽及幼根长 度的增加或减少值 并填入表中进行比较分析 实验实验 8 8 脱落酸浓度对小白菜种子落芽率的影响脱落酸浓度对小白菜种子落芽率的影响 实验实验 植物体内脱落酸 赤霉素的分离和测定植物体内脱落酸 赤霉素的分离和测定 在研究植物生命活动过程中 常常需要准确了解某一激素的含量以及 各激素间的比例 因此 植物内源激素的提取分离和测定是植物生理学实验技 术中极其重要的内容 本实验以 ABA 和 GA 为例 介绍激素的提取 分离及测定 的基本原理和方法 一 原理 利用脱落酸 abscisic acid ABA 和赤霉素 gibberellic acid GA 能溶解于有机溶剂 如丙酮 甲醇 的特性进行提 取 将粗提物经过一系列的分离技术 如萃取 薄层层析或纸层析等 使 ABA GA 与其它成分分离 再对纯化的 ABA 和 GA 进行生物学鉴定或物理化学鉴 定 一 生物鉴定 1 ABA 能抑制植物器官的生长 在一定的浓度条件下 其 抑制程度与浓度呈线性关系 利用这一线性关系就可确定组织中 ABA 的含量 2 GA 能刺激幼嫩植物的节间伸长 特别是矮生植物的茎 在一定浓度范围内 茎的伸长度与 GA 浓度呈线性关系 因此 根据茎的伸长度就可确定 GA 的含量 二 物理化学鉴定 可采用气相色谱法 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 植物叶片 水稻种子及幼苗等 二 仪器设备 1 气相色谱仪 2 分液漏斗 3 组织匀浆器 4 旋转蒸 发干燥器 5 层析缸 6 华特曼 3 号层析纸 7 微量注射器 三 试剂 1 100 甲醇 2 80 甲醇 3 石油醚 4 乙酸乙酯 5 1mol LHCl 6 硅酸 GF232 7 氯仿 8 GA 9 ABA 10 乙醇 11 正丁 醇 12 异丙醇 13 3mol L 氨水 三 实验步骤与结果计算 一 脱落酸和赤霉素的提取和分离 1 样品提取 1 取新鲜材料或贮存材料 用 100 甲醇固定 放置 10 冰箱中至待测时 10g 剪碎 加入 60ml 预冷 0 的 80 甲醇溶液 匀 浆 5min 匀浆液在 4 下振荡 或搅拌 24h 过滤 残渣再用 20ml 甲醇液振 荡 1h 反复二次 滤液混合 2 将滤液在旋转蒸发器上干燥减压蒸发 36 38 至原体积一半 再加入 10ml 石油醚提取部分色素 将下层甲醇液 取出 弃掉石油醚层 继续减质浓缩至水溶液 在此水溶液中含有 IAA ABA GA 和 CTK 等 2 样品萃取将水溶液用 1mol LHCl 调 pH 至 2 8 2 5 左右 并以与水溶液 等体积的乙酸乙酯萃取 将混合溶液装入分液漏斗 分离水相和乙酸乙酯相 取水相再用乙酸乙酯萃取 2 次 合并乙酸乙酯溶液 此时 CTK 细胞分裂素 存在于水相中 而 ABA GA IAA 存在于乙酸乙酯中 3 样品的纯化 1 将乙酸乙酯溶液用旋转蒸发器浓缩至干 用 2ml100 甲醇溶解残留物 2 点样 取 100 l 甲醇溶液点在涂有硅胶 GF254 玻板下 端 1cm 处 或点在华特曼 3 号层析纸上 并在同一水平上分别点上标准 GA 和 ABA 溶液 100 l 3 展层 用异丙醇 28 氨水 水 10 1 1 V V V 作为展层剂展层 前沿至玻板顶端 0 5cm 处即停止展层 4 定位 层析完毕后 吹干玻板并在紫外灯下观察色带 与标准 ABA 和 GARf 值相同或相近的色带 就作为纯化后的 ABA 和 GA 5 洗脱 将 ABA 和 GA 带分别括下 或剪下 用 95 乙醇浸提 3 次 溶液经减压蒸干后 即可进 一步作生物学测定或气相色谱测定之用 二 ABA 和 GA 的测定 1 ABA 的生物学鉴定 1 材料培养 精选小麦种子 25 黑暗下浸种 2h 排于培养皿湿滤纸 上 在 25 下发芽 待胚根出现后 移入培养缸中的塑料网上 继续在 25 暗 中培养 约 72h 后 选取胚芽鞘 2 8 3 0cm 的幼苗 用刀片自顶端分别切成 3mm 5mm 5mm 三小段 取中间 5mm 切段置蒸馏水中 2 3h 备用 2 ABA 母液 200 g ml 的配制 称取 20mgABA 溶于少量酒精 以无离子水定容至 100ml 3 标准溶液的配制 吸取 5ml 母液 加无离子水定容至 100ml 即 为 10 g ml 吸取 5ml10 g mlABA 溶液 用 2 蔗糖 0 01mol L 磷酸缓冲液 pH5 0 定容至 50ml 即为 1 g mlABA 标准液