分离小鼠心肌细胞protocol

分离小鼠心肌细胞分离小鼠心肌细胞 ProtocolProtocol 实验动物 小鼠 体重 20 30g 1 急性分离心肌细胞急性分离心肌细胞 A 实验准备实验准备 1 无钙台氏液 配 500mL 无钙台氏液 50mL 台氏母液 450mL 去离子水 1g 葡萄糖 用 NAOH 调 PH 一般在 7 35 7 4 之间即可 注 充氧后调 PH 值 否则充氧后 PH 下调 调 PH 值前严格校正 PH 计 小鼠心肌细胞对 PH 值特别 敏感 表 1 台式母液配方 mM MW g L g 500ml 10 x NaCl12658 447 36336 82 KCl5 474 550 4032 02 Hepes10238 32 38311 92 MgCl2 6H2O1 0203 30 2031 02 NaH2PO4 2H200 33156 010 0520 2574 CaCl21 8147 03 Glucose10198 2 注 CaCl2 Glucose 配制时后加 浓度 0 9M CaCl2母液 6 616g 有水 或者 4 995g 无水 50ml 去离子水 0 2ml CaCl2母液 100ml 无钙台氏液 2 称取 5mg 胶原酶 8mg 白蛋白 3 配有钙液 200ml 即 200ml 无钙液 0 4ml CaCl2 0 9M 注 小鼠心肌细 胞对钙浓度特别敏感 我们为了缩短心脏复跳时间 减少心肌耗氧 把有钙液 中钙离子浓度降到正常的 浓度的 1 4 4 准备器械 大弯剪刀一把 小直剪刀两把 直镊子两把 止血钳两把 弯镊 子两把 纱 布一块 注射器 60mL 一个 10mL 一个 手术线一团 小鼠主动脉比较细 手 术线比大鼠的要细 表面皿三个 小烧杯 50mL 三个 量筒 50mL 两个 500mL 一个 大烧杯 500mL 一个 250mL 一个 滤纸若干 滴管 4 个 7 号注射 针头一个 尖端磨平 靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主 动脉时系线 5 KB 液配方 mM MWg L Glutamic acid 谷氨酸 70 147 13 10 3 Taurine 牛黄 酸 15 125 14 1 875 KCl 30 74 55 2 237 Hepes 10 238 3 2 383 MgCl2 6H2O 0 5 203 3 0 1015 Glucuse 10198 21 982 EGTA 0 5380 40 19 KH2PO4 10136 091 36 注 5M KOH 调 PH 值 7 3 7 4 5M KOH 配制 28g KOH 溶于 100ML 去 离子水 KB 液保存在 20 冰箱中保存 B 实验过程实验过程 1 1 实验前准备 实验前准备 1 准备仪器 电热恒温器 带水泵的 Langendorff 灌流系统 2 检查氧气瓶里是否有氧气 3 打开恒温灌流装置的电源开关 调节电热恒温器的水温 泵出的水打 入冷凝管 使通过冷凝管的灌流液保持 37 的恒温 4 清洁 Langendorff 管路 第一次使用先泡酸后用蒸馏水冲洗干净 以后 每次使用前先用去离子水将 Langendorff 管冲洗 3 遍即可开始实验 5 配制好无钙的细胞外液及有钙液 并取约 50ml 有钙液置于表面皿中后 放置在冰袋上 使其温度降到 0 左右 另一 50ml 有钙液置于表面皿中放入 4 冰箱待用 6 向冲洗后的 Langendorff 管中加入有钙液 用注射器轻轻吸出气泡 并 向管中通入氧气 有钙液浓度降到正常浓度的 1 4 灌入大概 50ml 有钙液 上 面倒无钙液 7 分别称取 5mg 胶原酶和 8mg 白蛋白 用约 50ml 无钙液溶解 备用 8 10ml 注射器连接预备好的 7 号针头 手术线打松结待用 2 2 正式试验 正式试验 1 选取小鼠 称重 用 1 戊巴比妥麻醉 腹腔注射 麻醉剂剂量尽量小 如果无需监测心电可采用断髓法处死小鼠 不必打肝素 肝素抗凝同时对心脏 也用副作用 2 待麻醉充分后 迅速开胸取出心脏 取心脏时切忌用手碰到心脏 首 先用小直剪刀靠近头段剪断主动脉 用另一只手持直镊子提起肺组织 从下方 游离心脏 放到 0 的有钙液中洗涤 可以轻轻的用食指按压心脏 使心脏内 的血液蹦出来 同时观察蹦出来的动脉孔 即主动脉 分离出主动脉 主动脉 不能分离太长 同时去除心包膜 即周围的组织 动作要迅速 主动脉一般位 于两个白色胸腺下方 主动脉上端可见其三个分支 沿分支处剪断主动脉 暴 露主动脉干出口 用预备好的连在 10ml 注射器的 7 号针头轻轻插入主动脉 用手术线固定主动脉 使灌流针头在主动脉的根部即可 太向下或者太向上灌 流效果都不好 一般在肺动脉圆锥上端 将 Langendorff 管上三通打开 液体 流出 然后把固定心脏的 7 号针头连接到 Langendorff 管上 用有钙液灌流 同时观察肺动脉流出道是否被堵住 如果堵住立即用小剪刀剪开 同时观察液 体流下的速度 调节灌流针的深度 待心脏跳动几次后 加入无钙液 直至心 脏停止跳动 完全停止 否则影响酶的消化 同时用拇指和食指轻轻挤压心脏 感觉硬度 无钙液灌流时间稍微长一点比较好 停跳后 10 20 分钟加入预先配 好的胶原酶和白蛋白混合液 先弃掉 20mL 而后开始计时 大约 30min 心脏颜 色变浅 质地变软时 煎取少许右侧心肌组织放到 KB 液中 待有细胞下来时 将剩余心肌组织取下 用剪刀轻轻剪周围组织 不要剪断 然后将组织放到 KB 液中用吸管吹打 吹打时细胞下来 而组织相对保持完整形态比较好 吹打完 细胞 剩余组织扔掉 心肌细胞保存在 KB 液中 稳定一小时后待用 小鼠心肌 细胞消化时长大约在 30 50 分钟 3 试验结束后 用去离子水冲洗整个管路系统 防止酶残留在管路中剩余 的无钙液配成有钙液 2 2 实验室溶液配方实验室溶液配方 普通电极液 普通电极液 Pipette solution in mmol L KCl 20 K aspartate 110 MgCl2 1 0 HEPES 5 EGTA 10 Na2ATP 5 at pH 7 2 用 KOH 调 pH 至 7 3 有钙台式液 有钙台式液 Tyrode solution containing in mmol L NaCl 126 KCl 5 4 MgCl2 1 CaCl2 1 8 NaH2PO4 0 33 glucose 10 and Hepes 10 用 NaOH 调 pH 至 7 4 3 3 实验过程记录电流实验过程记录电流 protocol 内向整流钾通道电流记录内向整流钾通道电流记录 protocol 将电压钳制于 40 mV 从 120 mV 至 50 mV 以 10 mV 为步阶 脉冲持续时间 为 300 ms 可记录到内向整流钾电流 50 mV 40 mV 120 mV 瞬时外向钾通道电流记录瞬时外向钾通道电流记录 protocol 将膜电位钳制于 50 mV 给予 1 个 100 ms 的脉冲刺激 该脉冲在 40 mV 至 50 mV 以 10 mV 递增 50 m