血清谷丙转氨酶活性的测定.ppt

赖氏法测定血清谷丙转氨酶活性 ALT 目的要求 1 掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理 2 熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法 3 了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义 实验原理 ALT催化丙氨酸与 酮戊二酸之间的氨基转移 生成丙酮酸和谷氨酸 在37 pH7 4 经30min反应之后 加入2 4 二硝基苯肼终止反应 并与反应中的二种 酮酸生成2 4 二硝基苯腙 在碱性条件下显红棕色 于波长505nm处读取A值 两种苯腙的吸收光谱曲线在500 520nm处差异最大 丙酮酸苯腙的呈色强度是 酮戊二酸苯腙的3倍 据此可以计算出丙酮酸的生成量 后者与血清中的ALT的活性浓度成正比 实验原理 丙氨酸 酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 ALT 2 4 二硝基苯肼 酮戊二酸 2 4 二硝基苯腙 丙酮酸 2 4 二硝基苯腙 0 4mol LNaOH 红棕色 红棕色 三倍 卡门单位 1ml血清在25 340nm 体积为3ml 光径为1cm每分钟光密度下降0 001的酶量 1 主要器具 微量移液器 实验仪器 可见分光光度计 实验试剂 1 0 1mol L磷酸盐缓冲液 pH7 4 2 基质缓冲液精确称取D L 丙氨酸1 79g 酮戊二酸29 2mg 先溶于0 1mol L磷酸盐缓冲液约50ml中 用1mol LNaOH调pH至7 4 再加磷酸盐缓冲液至100ml 每升底物缓冲液中可加氯仿防腐 4 保存 3 1 0mmol L2 4 二硝基苯肼溶液4 0 4mol LNaOH溶液5 2 0mmol L丙酮酸标准液6 待测标本 病人血清或质控血清 操作步骤 1 待测血清的测定 混匀 室温放置5min 在波长为505nm处比色 蒸馏水调 0 操作步骤 2 校正曲线的制备 混匀 室温放置5min 在波长为505nm处比色 蒸馏水调 0 取7支试管 按下表操作 混匀 室温放置5min 在波长为505nm处比色 蒸馏水调 0 实验结果 1 校正曲线的制备以标准管各管的A值 0 号管的A值 所得差值与对应酶卡门氏单位作图 即成校正曲线 2 测定管测定管A值 对照管A值 根据所得差值 从校正曲线查得标本中ALT的卡门氏单位 参考值范围 5 25卡门单位 注意事项 1 血清和底物应于37 水浴后操作 最好置37 水浴箱中操作 以一定时间加入 各管即时混匀 以第一管开始计时 准确反应30分钟 各管加入时间间隔一致 保证每管反应时间均为30分钟 2 加入2 4 二硝基苯肼溶液后 应充分混匀 使反应完全 3 加入NaOH溶液的方法和速度要一致 如液体混合不完全或加入速度不同均会导致吸光度的差异 4 底物和显色剂均为呈色物质 称量必须很准确 5 呈色的深浅与NaOH的浓度也有关系 其浓度越大呈色越深 但其浓度 0 25M时 吸光度下降变陡 因此浓度要准确 方法学评价 1 重复性差1 由于限制了 酮戊二酸的用量 使生成量与酶活性不能呈现良好的线性关系 2 2 4 二硝基苯肼在碱性条件下也能显色 为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的2 4 二硝基苯肼 此种水平的苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应 3 产物旁路效应 丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗 方法学评价 2 准确性差 线性范围狭窄 尽管标本采用稀释后测定 但偏差仍较大 3 试剂稳定性差4 操作简单 临床意义 肝细胞中含ALT最丰富 因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时 ALT即大量释放入血液 致使血清中ALT活性增高 测定ALT是检查肝功能的重要指标之一 1 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死 2 中等程度增高见于肝癌 肝硬化 慢性肝炎及心肌梗塞 3 轻度增高