裂殖酵母方法作为一种新应用于皮质酮甲基氧化酶缺乏引发突变的研究.docx

裂殖酵母方法作为一种新应用于皮质酮甲基氧化酶缺乏引发突变的研究摘要:醛固酮合酶,cyp11 B2,催化11-去氧皮质醛固酮的转化。这个过程需要三个步骤：首先，在11位点的羟基化，形成皮质酮，接下来，在位置18羟基化产生18-羟基皮(质甾)酮，最后，在18位点的氧化形成醛固酮。醛固酮缺乏症作为一种危害生命的电解质紊乱疾病，经常发现在婴幼期表达，原因是CYP11 B2基因的突变。因此，在突变和酶活性的深入研究将会为CYP11 B2缺失引起的醛固酮缺少症的诊断和处理提供信息。在这里，我们报道一个快速又廉价的，关于全细胞CYP11 B2突变的酶学性质的技术的发展。新系统的原理是在裂殖酵母里cyp11 B2突变体的内源性表达，其次是类固醇的生物转化试验的突变体酶的表征。 新的系统验证和CYP11 B2 10个已知的突变已被研究，他们中的两个首次涉及到对CYP11 B2三步反应的影响。裂殖酵母系统的结果与细胞培养表现的结果十分吻合，表现出了新系统可以作为一种非放射性的方法应用于CYP11 B2突变的酶学性质的研究。引言:细胞色素P450在人体肾上腺内合成胆固醇激素扮演着很大的角色，比如说皮质醇和醛固酮的生产。醛固酮，人体内最重要的盐，涉及到人体内的盐和水平衡的调节，从而能够调节人的血压。在人体中，醛固酮的合成通过细胞色素P450的一些酶介导合成的，而在这些色素酶中醛固酮合成酶催化终端的三个步骤，首先11-去氧皮质酮（DOC）的11-位点的羟基化，生成皮质酮（B）；然后在18位点的羟基化产生18-羟基皮质酮（18OHB），最后，在18位点氧化形成醛固酮（图表1）。醛固酮的生物合成不足是由CYP11 B2基因缺陷引起的，它被称为皮质甲基氧化酶（CMO）缺陷（图表1）。在CMO 1缺陷中，这种突变将会导致CYP11 B2基因的完全失活，或则导致其活性的显著降低。相比于CMO1突变，CMO 2突变的临床图片揭示CMO 2突变仅仅只会导致在终端18-氧化步骤进行封锁。 查看文献可以知道，一些研究在在患CYP11 B2的醛固酮缺乏症的病人中进行，一系列的反义突变已经被报道。由于醛固酮缺乏的一些病人显示出一些错义突变经常同时发生，对于每一个突变对于CYP11 B2基因活性的影响的研究都具有很高的诊断和治疗的意义。然而，所有的报道都是利用细胞培养和放射性基板的方式用来在CYP11 B2突变体的研究中检测类固醇的生物转化机制。CYP11 B2的酶活性的评定通常是运用放射性标记DOC（或者B）或者放射性检测的方式来实现（例如高效薄层层析和放射自显影或者放射免疫等方法）。由于这个原因，这些手段没有一个能够被考虑作为高甚至中等通量的检测系统被用于在同一时间研究几个位点的突变。Bureik等人在2002年报道了裂殖酵母能够异源表达人体的CYP11 B2基因。令人惊奇的是，CYP11 B2显示能够与内源性氧化还原伙伴一起支持DOC生物转化成B，18OHB和醛固酮。然而，CYP11 B2酶的活性在重组裂殖酵母中的研究依然用的是放射性标记的研究基板。因此，本研究的目的就是发展一种新的能够在CYP11 B2大规模突变进行研究酶的特性的技术。为了达到这个目的，裂殖酵母系统被重组再加上高效液相色谱的方法（HPLC）是为了建立一套强大的非放射性的CYP11 B2突变体的分析方法。图表1：人体CYP11 B2催化反应。CYP11 B2转化去氧皮质酮（DOC）经过皮质酮（B）和18-OH-皮质酮（18OHB）到醛固酮。2.材料和技术2.1 化学试剂和酶Sigma公司的类固醇。所有使用的有机溶剂都是高效液相色谱级别的，高效液相分析所用的去离子水都是经过Milli-Q Biocel系统处理的，限制酶都是来自Promega and NEB公司的。2.2 媒介和大体技术研究裂殖酵母的媒介和大体技术已经详细描述。裂殖酵母的培养在30的在Edinburgh最小限度的培养基并按需要进行补充。2.3 分子生物技术大体的DNA手段一般用标准的技术进行。本研究使用的cDNA为野生型CYP11 B2基因，不同于Kawamoto等人报道序列。在以下位点Leu106Pro, Arg249Ser,和Glu258Gly。虽然Arg249Ser作为一种CYP11 B2的SNP被报道,但是发现在这使用的变种的Leu106Pro和Glu258Gly在独立的cDNA中发生了改变。以前报道的在裂殖酵母中CYP11 B2基因的表达，它的表达载体pINT5-CYP11B2在本研究中被当做一种在裂殖酵母中构建CYP11 B2突变株和其表达的模板。表达野生型的CYP11 B2裂殖酵母菌株MB164在本研究中当做一种参考菌株与本实验构建的裂殖酵母CYP11 B2突变株的酶活性进行对比。对于CYP11 B2突变株表达的裂殖酵母菌株的构建，裂殖酵母株NCYC2036像之前为亲本株MB164一样被使用。在使用表达载体pINT5-CYP11B2和pfu DNA-聚合酶，CYP11 B2基因的诱变已经被完成（Promega公司，曼海姆，德国）。用沉默位点选择的程序对构建CYP11 B2的错义突变的一系列成对寡核苷酸（引物）进行设计（表1）。设计的引物能够诊断限制性内切酶的插入和缺失，则确定为我们所需要的CYP11 B2突变株。然后通过自动测序进行进一步的确认（测序引物见表1）。2.4 裂殖酵母菌株NCYC2036的转化用冻存的裂殖酵母细胞，CYP11 B2突变表达pINT5载体进行NCYC2036转化。pINT5是一种含有在酵母细菌里使用的pUC起源序列的穿梭载体，酵母成分里含有表达盒，Ura4标记和侧翼leu1序列。在转化中，pINT5-CYP11B2用NotI内切酶消化去阻断含有CYP11B2表达盒的酵母组件，随后通过琼脂糖凝胶电泳纯化。分离碎片插入到酵母细胞的完成是通过与侧翼leu1基因序列同源重组的方式插入到酵母细胞的染色体上。在转化之后，整合了正确的碎片（染色体上的LEU1基因）的转化菌株的营养缺陷型由尿嘧啶缺陷转变为亮氨酸缺陷型。然后通过在30，在缺乏或含有0.1g/l的亮氨酸的EMM板上进行电泳将它们分离和鉴定。2.5 体内类固醇的羟基化的测定在300ml纤维素包裹的宽颈圆底烧瓶中进行生物转化，可以几个样同时进行生物转化。裂殖酵母菌悬液的制备用含有尿嘧啶（在亲本株NCYC2036的情况下）或者亮氨酸（在构建的菌株和参考菌株MB164的情况下）等所需要的补充物的新鲜的EMM调至浓度0.1g/l。10ml的细胞菌悬液作为底物加入锥形瓶和DOC中。将烧瓶置于30，180rpm的条件下进行培养，500ul的多个样品在-20处理贮存适当的时间知道可以进行类固醇的提取。样品然后用相同体积的氯仿进行二次提取。旋转蒸发出去氯仿，类固醇溶于甲醇在用HPLC进行测定。2.6 HPLC分析用Jasco系统（日本，东京）进行HPLC分析，它由AS-2050自动取样器，PU-2080泵，LG -2080- 02梯度混合器和UV -2075检测器再加上由马歇雷-内格公司提供的反Nucleodur100-3 C18的柱子组成。柱子保存在35的恒温箱中。流动相为甲醇：水50:50,A（水）和B（甲醇）。梯度洗脱的程序的固定流速为1ml/min(表2)。类固醇的检测波长在240nm处，用ChromPass软件进行峰值的分析鉴定（(V.1.7.403.1,Jasco)。进行HPLC时，以纯类固醇（99%）作为标准，进行峰值分析（图2）。表1特异性诱变位点和测序的引物序列。粗体字的为质粒pINT5 CYP11B2和引物之间不同的碱基序列。下划线为不同酶的识别位点。最后三行为所需测序的引物。表2转化CYP11B2基因用于分析类固醇的梯度洗脱程序图2相同条件下，CYP11B2生物转化合成的类固醇和分离的纯类固醇的高效液相色谱图由于样本中的现有的类固醇是化学性质和物理性质相似的分子。假定相对损耗的情况