稳定性同位素示踪法.ppt

第六章稳定性同位素示踪法概述 1 1912年 Thomson首发现稳定性核素20Ne和22Ne 氖 2 1929年 Naude发现了15N 3 1937年 Urey等首次报道人工生产15N的方法 4 1940年 先后获得具生物意义的15N 18O和3H大量生产 5 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了 同位素在生物学和医学中应用 专题讨论会 从此开始了稳定性核素示踪技术应用的新纪元 6 近20年 稳定性核素示踪技术迅速发展 分离分析方法取得了较大突破 13C 2H 18O 15N广泛应用于生物学 医学 环保 农药 农学 微生物等研究领域 我国先后分离了25种元素的100多种稳定性核素 例如 15N标记化合物就有30余种 几个概念稳定性同位素 Stableisotope 丰度 Abundance A即某核在该组同位素中浓度 通常指人工加浓了的 自然丰度 Naturalabundaa A自 AO 15N 0 365 18O 0 204 原子百分超 Atompercentexcess aa A A自又称富集度 Enrichment 富集15N Enriched15N 贫化15N Depeled15N 一 稳定性同位素示踪法的基本依据 1 自然界中一种元素同位素组成是相对恒定2 同一元素的同位素具有相同的化学性质3 同一元素的同位素之间存在质量差异 重要化学元素的稳定性同位素元素同位素自然丰度样品来源H1H99 985新鲜的表面淡水2H D 0 0147B10B18 46意大利天然硼酸盐11B81 54C12C98 892捷克扑利兹石灰石13C1 108N14N99 635大气中的氮气15N0 365O16O99 759大气中的氧气17O0 037418O0 2039 氮的同位素表同位素射线种类半衰期自然丰度12N 0 011S13N 9 96m14N 99 63515N 0 36516N 7 1S17N 4 15S18N 0 63S 稳定性同位素标记物的命名1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名法 结构式 15 N HCl或15NHCl 这样純的物质不存在 单标记化合物 H215N CO NH215N 尿素 例如15N的丰度可为5 10 15 双标记化合物 一个同位素 H215N CO 15NH2尿素4 混合标记化合物 15NH2 13CO 13C15N 尿素 核素A 质量数14N99 6351415N0 36515注意 由于同位素之间的质量差异 因此它们的物理 化学 生物化学等性质会有所不同 进行实验时 需注意同位素效应 二 稳定性同位素示踪法的特点 1 无放射性 无辐射效应及不良影响 2 安全 对人无伤害 3 无污染 不受环境条件限制 4 无衰变 实验时间不受限制 5 可进行放射性示踪法难以进行的实验 例 N素中T最长的13N T 9 096m 一三 稳定性同位素分析法的基本流程同位素引入生物体动植物原始样品仪器所需的待测样品 进样过程质谱分析法光谱分析法记录实验结果分析 四 影响15N引入丰度的因素1 实验材料对15N的稀释程度 2 N素在不同部位分布的不均匀性3 分析测定技术所能达到的精度 15N示踪法引入N素肥料的丰度计算参考公式af Wp Rp ap Nf RN式中 af N素肥料的原子百分超Wp 植物总重量 待测 ap 植物样品中原子百分超Rp 植物样品中含N百分率 Nf 施纯N量RN N肥利用率 注意事项 1 同位素交换反应 在一定条件下 标记的铵盐可与大气发生反应 15NH 4水溶液 14NH3 14NH 4水溶液 15NH315N丰度高时应注意 2 同位素效应 藻类对14C 13C 12C的吸收依次递减 3 予测样品测定项目 五 质谱和光谱测定15N原理14N和15质量不同质谱 把N2离子化为28N N2 29N N2 30N N2使其在均匀磁场中发生不同角度偏转2光谱 28N N2 谱线波长为2976 8埃29N N2 谱线波长为2982 9埃30N N2 谱线波长为2988 6埃 入口 出口 加速电压 1800的均匀磁场 六 供仪器待测样品的制备 测量1 对待测样品的要求 1 因为测量的是不同质量离子流的相对含量 因此 保证有一定的N量即可 一般要求含N量1mg ml最少不低于0 5mg 2 仪器的本底检查 3 离子峰的选择 14N和15N的峰比28N 29N小10倍 选28N 29N 30N 4 仪器精确度检查 检查去O2后的空气或纯N气 2 分析样品的制备 1 K氏法 Kjeidali 质谱分析常用法 A 样品的消化 例 0 05g植样 10ml浓H2S04 3 3gSe CuSO4 K2SO4为1 10 100混合催化剂 样液清亮再消煮5h 土 或2h 植 温度120 140 样品予处理 水杨酸 硫酸法 5g干土或0 5g植样 12ml水杨酸 硫酸为50g 1000ml溶液中放置30min 再加2 5g硫代硫酸钠和15ml水 缓缓加热至停出起泡 冷却 常规消化 B 蒸馏 用蒸汽蒸馏将消化液中NH3分离出来 并测定总N 方法 消化液中加过量40 NaOH 释放的NH3被蒸汽逐出 经冷凝后被2 硼酸吸收 加入混合指示剂用标准硫酸滴定 设置一个标准液 此步骤将NH3 N转变成了NH4 N 铵态N 仪器分析适宜量1mgN 样品2 3ml 浓缩或稀释 制备好的样品送交仪器分析 以下在质谱仪上进行C 将NH4 N转化为N2气 在真空条件下 将上述样品与次溴酸钠反应 放出N气 在质谱仪内进行 详见书15N章节 制样时注意 1 所有试剂纯度要高 2 消化要完全 3 防止样品间交叉污染 每个样品蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿 4 Y 型管及内部反应抽气须彻底 防其它气体干扰 以下在光谱仪上进行 可用液体样品也可用干样品 2 杜马法 Dumas 光谱分析中常用法适用于含N量低 少于100 g 的样品 光谱测量 方法 A 在放电管中装入样品 氧化剂 CuO 及吸收剂 CaO 抽真空 抽完后熔封放电管 在马福炉中燃烧0 5 3h 560 样品 CaO吸收CO2和H2O 以产生N2气 B 冷却至室温后在光谱仪上测定纯样品火焰为粉红色或淡黄色有CO2呈白色 有水呈黄色 注意 如果是液体样品 需用Pyrex玻璃管 1cm 2mm 吸满样液 烘干后再放入放电管 CuO CaO使用前用700 高温烘干除去CO2 H2O 并在12 18Kg cm2压力下制成棒状 备光谱分析 仪器分析方法步骤 1 通电予热仪器10分钟 打开光电倍增管高压 2 放电管装入燃烧室固定架上 3 开高频发生器电源 使放电管中样品放电发光 4 选择适宜放大倍数对28N 29N 30N峰分别进行放大 在2970A0 2990A0之间扫描 5 放下记录笔 接通扫描开关 划出28N 29N 30N峰高 6 求得平均峰高 计算15N丰度 七 15N实验结果计算14 15的质量比28 29 30的小10倍 不参加运算当15N丰度小于5 R 质量为28离子流强度 质量为29离子流强度此时30N的流子离强度很小 1 丰度 A 1 2R 1 100 1 当15N丰度大于5 R 质量为29离子流强度 质量为30离子流强度A 2 R 2 100 或者由质量为28 29 30的峰值直接算出 A 29 2 30 2 28 29 30 100 以下以植物材料实验为例进行计算 其计算原理也适用于动物等 共同的条件是在一个相对封闭系统内开展实验 若是用32P等实验 计算时把原子百分超换成比强度即可 2 植样的原子百分超 apap A A自 2 A自 0 365 或空白实验值 3 植物从肥料中摄取N的 Ndff植物中N有多少 是来自于肥料 Percentageofintheplantderivedfromthefertilizer 可以是根 茎 叶 果实的任一NdffNdff ap af 100 设N素来源于土壤和肥料二方面 3 af 肥料N的原子百分超 或动物饲料N的原子百分超 此时又多了一个动物排泄因素 上片解释见第五章第37片同位素稀释法 4 植物从土壤中摄取N的 Percentageofintheplanttissuederivedfromthesoil NdfsNdfs 1 Ndff 4 5 植物中来自肥料的N量 NpfNpf 植物总N量 ap af 5 Npf Nps 植物中总N量 已在定N中测定 K氏定N法 設总N来源于土壤和肥料 则 6 植物中来自土壤N的量 NpsNps 总N Npf 6 7 N素利用率 R Npf Nf 100 7 Nf 施入纯N的总量8 土壤A值 A值 Ndfs Ndff Nf Kg 公顷 8 A值 表示土壤有效供应N素量 用A值可以解释为什么某种土壤适合于种植某种植物 来自 A值 Ndfs Nf Ndff 9 N素回收率 R回 已检出的Nf量 Nf 100 9 10 N素损失率 R失 100 R回 10 以上公式适用32P等放射性物质 以比强为单位 等计算 练习题 蕃茄实验地中施用15N 尿素纯N20Kg 亩 收获后测得植物含N量为30Kg 亩 植物样品的15N丰度为0 67 15N 尿素的15N丰度为1 37 设自然丰度为0 37 尿素的含N量为40 求 1 每亩施入尿素量 2 肥料N素的利用率 3 A值 解 ap 0 67 0 37 0 3 af 1 37 0 37 1 0 Ndff ap af 0 3 1 0 30 Npf Np Ndff 30Kg 亩 30 9Kg 亩施入尿素量 W 20 40 80Kg 亩肥料N素利用率 R Npf Nf 9 20 45 A值 Ndfs Ndff Nf 70 30 20Kg 亩 46 7Kg 亩 土壤中可供蕃茄生长的每亩有效N 当然不是全部被吸收 A值愈大说明土壤的供N能力愈强 下列研究方法 1 测根瘤数目和干物质产量 早 有无 2 氮素平衡法 十分烦琐 3 比较固N作物和非固N作物总N量差异 4 乙炔还原法 简单 灵敏 5 乙炔还原成乙烯 存在转换因子 3个 15N示踪与生物固氮 以下各方法简讲 工业固氮 Haber Bosch反应 N2 3H2催化剂 45 200在气压2NH3生物固氮 N2 6H xATP6e 固氮酶2NH3 xADP xPi 6 同位素法 15N2还原法 Burris 1941 充15N2密室进行NdfA a样 a气 100 固氮量 NdfA 总N量 同位素稀释法 J O Legg等 1975 15N施入土壤NdfA 1 a固 a非 AN值法 M Fried等 1975 田间种固N 非固NNdfA As Afix As NdfF AfAs Af Afix分别代表土壤 肥料 大豆有效N量 NdfF 来自肥料N素的比例 八 13C示踪法1 样品的制备 1 样品碳转化为BaCO3 干氧化法 Pregl 如上图湿氧化法 Weinhouse1948 2 BaCO3 CO2转化 BaCO3 0 5 HCl 饱和NaCl 1 4 真空 冷却 2 测量 CO2在质谱中经电子轰击产生多种分子离子和原子离子 13C 1 R 1 100 R 45 44其中 45示 13C16O16O 和 12C16O17O 44示 12C16O16O m e 12C16O17O 可用校正峰解决 九 18O示踪法 样品制备 也是转化成CO2 很少用O2 N2O2 NO2 如 平衡法 H218O C16O2 H216O C18O2碳酸盐与酸反应 直接放出C18