链球菌、肠球菌

实 验 十球菌、肠道菌,目的要求：,1.掌握链球菌属及肠球菌属的分离培养与鉴定方法。2.掌握链球菌及链球菌的菌落特点、菌体形态及染色性。3.掌握抗“o”试验的操作及临床意义,链球菌的溶血性,溶血性链球菌,肺炎链球菌 S. pneumoniae,形态与染色：G+球菌,矛头状 ,成双排列，宽端相对，尖端向外,有荚膜,肺炎链球菌革兰染色有荚膜,肺炎链球菌 S. pneumoniae,培养特性：营养要求高，兼性厌氧。初次分离需提供5%-10%的CO2。,18-24h后血平板上形成灰白色、圆形、针尖样的菌落。菌落周围有草绿色溶血环。,肺炎链球菌 S. pneumoniae,培养特性：培养48h后，菌落有自溶现象，菌落的中心会出现凹陷，像“肚脐”称脐状凹陷。,肺炎链球菌 S. pneumoniae,主要生化反应 optochin试验: 含5g optochin 纸片贴于 涂布有待测菌的平板上35孵育过夜，抑菌圈大于14mm即为敏感。,痰标本肺炎链球菌革兰染色,A群(化脓性)链球菌,生物学性状,球形或椭圆形，链状排列，革兰染色阳性(G)， 无芽胞，无鞭毛，透明质酸的荚膜。,1. 形态与染色,化脓性链球菌,A群(化脓性)链球菌,生物学性状,营养要求高：血平板或含血清培养基； 液体培养为沉淀生长； 血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同 菌株溶血不一， 多数有透明溶血环(b溶血现象)。,2. 培养特性,杆菌肽敏感试验 原理：A群化脓性链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他链球菌对杆菌肽通常耐药。 方法：挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，将杆菌肽纸片（0.04U/片）贴于平板上，35孵育18-24h观察。 结果判断：出现抑菌环为敏感，推断为A群化脓性链球菌。,B,化脓性链球菌杆菌肽阳性,无乳链球菌CAMP试验阳性,CAMP阳性,Lancefield血清凝集分型,肠球菌属,步骤和方法1、菌落观察: 将菌株接种于血琼脂平板上，35孵育18-24h后观察菌落，肠球菌在血琼脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周围可出现溶血环，也可无溶血环。,2、形态观察 涂片、革兰氏染色镜检，记录镜下细菌染色性、大小、形态及排列。 肠球菌形态类似链球菌，为单个、成双或短链状排列的卵圆形革兰氏阳性球菌。,3、生化反应： （1）触酶试验：肠球菌属为阴性反应。 （2）胆汁-七叶苷试验： 原理：培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能在胆汁中生长，并水解七叶苷，使培养基变黑。,方法：将被检菌13个菌落接种于胆汁-七叶苷琼脂培养基，35孵育1824h。 结果：细菌生长，且培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。肠球菌为阳性。,（3）65g/L NaCl生长试验： 原理：肠球菌有很强的耐盐能力，能在65g/L NaCl血清肉汤培养基中生长，而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基中不能生长。 方法：将待检菌接种65g/L NaCl血清肉汤中，35孵育18-24h。 结果：细菌生长且使得培养基变黄为阳性，不生长为阴性，肠球菌为阳性。,（3）PYR试验： 原理：多数肠球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），释放出-萘基酰胺，与PYR试剂作用形成红色复合物。 方法：挑取被检菌落在含有PYR的纸片上涂擦， 35孵育5min，再于纸片上滴加PYR试剂，观察纸片颜色。 结果：约1min后纸片呈红色为阳性，不变色为阴性。肠球菌、A群链球菌和某些凝固酶阴性的葡萄球菌为阳性。,脑膜炎奈瑟菌,痢疾志贺菌,伤寒沙门菌,霍乱弧菌,结核分枝杆菌,白喉杆菌,破伤风杆菌,产气荚膜杆菌,白色念珠菌,肉毒杆菌,淋球菌,炭疽杆菌,二、抗“o”实验,1.实验原理：溶血性链球菌能产生溶血素“o”，链球菌感染患者，血清中可出现针对溶血素“o”的抗体。2.操作： （1）加待测血清，阴性、阳性对照血清各1滴 （2）将胶乳液轻轻摇匀后，每孔各加1滴胶乳试剂 （3）轻轻摇动玻片，使胶乳液与血清混合均匀 （4）每孔各用一个搅拌棒进行搅拌，使胶乳液与血清充分混合均匀。,三、操作过程,五、注意事项,1.不能使用过期产品2.搅拌棒的使用为每孔一个，不能混