动物实验graduate2013

第八章 医学研究中实验设计动物的选择及应用,动物实验与动物实验技术田枫2010.01,“Im so proud! All of my kids are going into research”,主要内容,动物实验中实验动物的选择人类疾病动物模型影响动物实验的因素动物实验基本技术如何做好动物实验,动物实验是根据研究目的，恰当地选用标准的实验动物品种、品系，进行各种科学实验，观察和记录动物的反应过程或反应结果，以探讨或检验生命科学中未知因素的一种活动。是生物研究中的重要方法之一，也是从动物身上获得有关情报资料的唯一手段。,关于动物实验,动物实验与诺贝尔生理或医学奖,动物实验与诺贝尔生理或医学奖（续）,动物实验中实验动物选择,相似性原则特殊性原则标准化原则规格化原则经济性原则,原则,相似性原则,利用与人体某些机能、代谢、结构及疾病特点的相似性选择实验动物组织结构：猪的皮肤组织结构与人类的相似系统机能：犬有发达的血液循环和神经系统，毒理方面反应 和人也较接近繁殖特性：哺乳动物和人近似，性成熟、妊娠期和寿命一般是 成比例的疾病特点：如旱獭肝炎病毒感染体液成分：鸟类粪尿混合排出；草食动物尿液呈碱性；肉食动 物尿液呈酸性。选择时要注意解剖特性：有些动物的解剖结构与人类差别较大，要特别注意,特殊性原则,发热、解热和检查致热源实验-适宜选用兔做实验；开胸和心脏实验-适宜选用兔做实验；观察药物对排卵的影响，进行避孕药研究-适宜选用兔、猫；动脉粥样硬化实验-适宜选用兔、猪、猴；肝外科实验研究-适宜选用大鼠；胆囊功能研究-不能选用大鼠；,充分利用不同品种品系实验动物存在的某些特殊反应,供研究用近交系小鼠,实 验 研 究 类 别 动 物 品 系心血管疾病 DBA2N自身免疫性疾病 NZBN、 脑积水 C57BLKaLwN、 D2nSnN肾盂积水 C57LN、STRN 白内障 STARN 牙周病 DBA2N (有抗力)、STRN (易感)多尿症 STRN、STR1N 白血病 L615、L7212腭 裂 AHeN (自发)、C57BL6N (诱发)放射线 有抗力：C57BL6N 敏感：BALBcAnN，LACA 淀粉样变 AHeN， NZWN补 体 BALBc AnN (活性高) DBA2N (活性低),人和实验动物在解剖、生理及代谢方面的比较,标准化原则,选择与研究内容相匹配的标准化实验动物，以保证实验的准确性与可重复性。标准化动物系指经遗传学、微生物学、环境及营养控制而繁育的动物。,规格化原则,年龄-年龄不同，其生物学特性往往不同，一般选性成熟后的青壮年动物。太小的动物的生理功能未达到成年水平。太老的动物的各器官老化，代谢功能下降，只在老年医学研究中使用；体重-在正常营养状态和饲养条件下，体重与年龄有一定的相关性；性别-许多实验证明，同一品种（系）不同性别的动物对外界刺激的反应不一致。,经济性原则,无菌兔,人类疾病动物模型,What is the Animal Model?,an animal model in which normative biology or behavior can be studied, or in which a spontaneous or induced pathological process can be investigated, and in which the phenomenon in one or more respects resembles the same phenomenon in humans or other species of animal.医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。,Classification of Animal Models,According to cause of the developingSpontaneous (genetic) disease models （自发）Induced (experimental) disease models （诱发/实验）Immunodeficiency animal model（免疫缺陷）遗传修饰动物模型抗疾病动物模型生物医学动物模型,Spontaneous (genetic) Disease Models,These models of human disease use naturally occurring genetic variants (mutants). Many hundreds of strains and stocks with inherited disorders modeling similar conditions in humans have been characterized and conserved.指实验动物未经任何人工处置，在自然条件下动物自然发生、或由于基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物模型。,Spontaneously Hypertensive Rats,Coat Color: AlbinoFeatures: used for studies in hypertension and cardiovascular research. Males, twelve weeks of age or older, dependably exhibit average systolic blood pressures greater than 200 mmHg. Progeny are monitored for elevated blood pressure to insure continued phenotypic expression of hypertension.,Details of Spontaneous Disease Models,血压测定,C3H Mice,Coat Color: Black AgoutiFeatures: The C3H is widely used as a model for drug treatments of neurologic disorders with applications in toxicology and oncology. High incidence rate of breast cancer in female mice and liver cancer in male .,Non-Obese Diabetic (NOD) Mice,Coat Color: AlbinoFeatures: The NOD exhibits destructive autoimmune pancreatic insulitis as early as four weeks of age. Insulin-dependent diabetes is seen in females by three months of age.,Senescence Accelerated Mouse,Established in the Department of Senescence Biology, Kyoto University, Japan as a novel murine model of senescence acceleration and age-associated disorders. This strain includes nine strains of accelerated senescence-prone, short lived mice (SAMP) and three strains of accelerated senescence-resistant, long lived mice (SAMR).,Senescence Accelerated Mouse,Each SAMP strain shows relatively strain specific age-associated pathologies. These characteristic pathological phenotypes are similar to age-associated disorders often observed in elder humans. They include senile osteoporosis, osteoarthrosis, age-related deficits in learning and memory with/without forebrain atrophy, presbycusis, senile amyloidosis, age-related impairment of the immune response and so on.,SAMP8,SAMR1,Moris,自发性动物模型,包括裸鼠、SCID小鼠、白内障小鼠、癫痫模型、肥胖症小鼠、无毛小鼠、高血压大鼠、青光眼兔等。,Assessment of Spontaneous Model,Advantages Spontaneously developing（自然发生） Similar to human diseases （与人类疾病有较好的相似性）Disadvantage Limited quantity and difficult to apply （数量有限，应用有难度）,Induced（Experimental) Disease Models,As the name implies, induced models are healthy animals in which the condition to be investigated is experimentally induced.以物理的、化学的或生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的改变，以供研究用。,Tumor Animal Model,Induced tumor animal model 使用致癌因素在实验条件下诱发动物发生肿瘤的动物模型。Transplant tumor animal model 指将动物或人体肿瘤移植同种或异种动物 连续传代而培养出的模型。,Details of Induced disease models,Cardiovascular Diseases Animal Model,Atherosclerosis model：animals fed by high-fat and high cholesterol diet or non-feeding method Hypertension model：kidney packing、renal artery coarctation、noise stimulusMyocardial ischemia and myocardial infarction model： electric stimulus、drugs、coronary artery blockage,Diabetes Model,注射致高血糖因子，如生长激素、胰高糖素、糖皮质激素以及儿茶酚胺类激素等。注射化学物质引起胰岛细胞的损伤，如链脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶可造成胰岛细胞不可逆损伤；环丙庚哌、天门冬素酶等可引起细胞可逆性损伤。注射生物及生物制品引起细胞破坏，如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异可诱发若干品系的成年小鼠糖尿病。手术切除胰腺的大部分或全部，并给予高糖饮食刺激，引起继发性永久性糖尿病。,Assessment of Induced Model,Quantity enough（数量足够）Condition accord（条件一致）和自然产生的疾病模型在某些方面存在一定差异。,动物模型复制原则,相似性可重复性可靠性适用性和可控性易行性和经济性,Immunodeficiency Animal Model,Animals is certain or some immunodeficiency because of spontaneous or artificial methods.由于先天遗传突变或用人工方法造成 免疫系统某种或多种成分缺陷的动物。,Classification of Immunodeficiency Animal,Congenital Immunodeficiency animal （先天性） T-lymphocyte deficiency animal ：nude mice,nude rats B -lymphocyte deficiency animal ：CBA/N mice NK cell deficiency animal ：Beige mice Severe combined immunedeficiency：SCID miceAcquired immunodeficiency syndrom （获得性） primate,mice and cat AIDS model,T-lymphocyte Deficiency Animal,History of Nude Mice,1962年英国格拉斯哥医院Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛。1966年证实是由于第11对染色体基因突变所致。1968年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺。1969年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功。 由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。和纯系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（Inbred Nude Mice）新种。裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。,Anatomy and Physiology Feature,胸腺残留一些上皮样细胞；淋巴组织胸腺依赖区的淋巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。虽然有原始的T细胞，但缺乏成熟的T细胞。T细胞的辅助，抑制及杀伤功能不全。无接触敏感性，无移植排斥，无移植物抗宿主反应。B细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是IgM，只有少量IgG。 粒细胞功能较低，NK细胞活性高。,裸大鼠 Nude Rats,毛色特征：（1）白色，黑色，黑白相间；（2）部分个体在发育的不同阶段，会出现有毛和无毛现象的交替。品系来源： 1979-1980年期间，含有裸基因的8个近交系大鼠在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。2001年Charles River从NIH引入，进行剖腹产净化，命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。2008年11月维通利华从Charles River引入该品系核心群。,裸大鼠 Nude Rats,繁育信息：（1）1：1比例交配（rnu/rnurnu/+）（2）妊娠期21-23天，离乳期21天；（3）产仔数：10-12只/窝品系特征： 该品系没有胸腺，缺乏T细胞，在胸腺外周淋巴器官的主要区域表现为细胞群体衰竭特征。主要用途： 肿瘤生物学和肿瘤移植研究：皮肤肿瘤与皮肤癌、中枢神经系统肿瘤；外伤与整形外科面的研究。,注意,裸鼠并不是真正意义上的无毛，长毛是一种正常的生理现象。裸鼠出生后大约十天左右，在头面部、颈部可见稀疏的毛发生长；随着周龄增加，在躯干的其他部位也可见稀疏毛发的生长。这些穿透了表皮的毛杆也是严重扭曲的，而且经常在长到应有长度前就折断了。,KM Hairless Mice,A: Heterozygous mice at 10 months.B, C: Homozygous mice at 10 months.The mutant mouse is covered with sparse hair, and cannot open its eyes normally,Scd1ab-Xy mutation,B-lymphocyte Deficiency Animal,CBA/N,B cell function is low,Severe Combined Immune Deficiency Animal,SCID mice,CB-17小鼠中由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响B、T细胞的正常功能分化。外观体重与普通小鼠相同。对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡。SPF环境没有B、T 阳性标志细胞，对外来抗原无细胞和体液免疫NK、LAK细胞功能正常或增高；,Feature of SCID,The C.B-17-scid does exhibit extremely low levels of Ig in 20% of the mice at 12 weeks of age. The incidence of Ig will increase as the mice age. Despite this “leakiness” （渗漏）C.B-17-scids do not mount an antibody response to challenge by immunogenic material. (部分小鼠出现低水平的功能性T和B细胞,血清中Ig含量明显升高)。,C3H SCID小鼠,scid突变基因引入C3H小鼠中而育成C3H SCID重组近交系。C3H SCID小鼠与CB-17 SCID小鼠的不同除背景基因不同外，发现在三月龄时C3H SCID小鼠仅有15%可测到血清免疫球蛋白，而CB-17 SCID小鼠则达79%。C3H SCID小鼠并不因年龄的增长而增加血清免疫球蛋白阳性的比例，也不会随年龄增加血清中免疫球蛋白浓度。,SCID.BG小鼠,利用BALB/c- beige/beige同源近交系（congenic strain）小鼠将beige基因引入CB-17 SCID小鼠。beige基因突变小鼠降低体内NK细胞（Natural killer cells）活性。,NOD/Lt-SCID小鼠,用非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交，降低了Nk细胞活性。,SHO（SCID Hairless Outbred）,人们一直想让SCID小鼠拥有裸鼠无毛的优点Charles River Lab的研究人员自2007年开始就着手培育无毛的SCID小鼠，他们通过Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr这两个品系杂交，最终在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因的无毛封闭群小鼠模型SHO（SCID Hairless Outbred）.2008年6月，实验人员通过对比的方法将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上，研究发现，SHO除去具有与SCID小鼠相同的肿瘤生长特性之外，还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现的皮肤溃疡现象。,免疫系统人源化小鼠,将人的胚胎胸腺造血干细胞等移植到免疫缺陷小鼠，可有效地建立人类天然与适应性免疫系统。免疫系统相关疾病研究及免疫药物研发提供了良好实验模型。未来人源化小鼠模型的发展趋势是为免疫缺陷小鼠敲入多种人的基因，使小鼠体内表达人的细胞因子或其他受体，从而获得更好的人来源的细胞重建。,Other Immune Deficiency Animal,NZBW F1 野生色,WBB6F1W/WV （WBW/+XC5TBL/6WV/+）F1,Anaemia, gastric ulcer，bone marrow failure modelWhite,black eye,疾病动物模型的注意事项,没有一种动物模型能完全复制人类疾病，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体身上得到验证。尽可能使模型动物处于最小的变动和最少的干扰之中；动物进化的高级程度并不意味着所有器官和功能接近于人的程度；不能盲目使用近交系动物；查找文献并咨询动物实验所需动物和条件是 否可行，了解前人所积累的经验，避免低水平的重复或缺乏科学依据的盲动所造成人力 物力的浪费。,影响动物实验的因素,R=(A+B+C) D + ER:实验动物的总反应A:动物种间的共同反应B:动物品种，品系特有的反应C:动物的个体反应D:环境因素（包括实验处理）E:实验误差A,B,C是由实验动物本身的遗传因素决定的，被选择的实验动物，在严格控制环境因素D或改变其中某一条件后就可能得到一个理想的实验结果R。,动物对实验处理的反应可用以下公式表示：,小鼠肝炎病毒感染,裸鼠的肝脏病变,waste syndrome,出现消耗性疾病，给肿瘤免疫学研究造成严重干扰,实验动物方面,仙台病毒感染,仙台病毒感染肺病变,对麻醉实验和吸入毒理学研究等产生严重干扰,实验动物因素方面,最适宜温度20-24，温差：3或4,温 度,不同种类动物“热平衡”区的范围不同。在热平衡区，动物呈基础代谢率。如果环境温度降至低于热平衡区温度的下限，动物的代谢率将呈线性增长。如果环境温度高于热平衡区温度的上限，代谢率也将增长，这不是防御机制，而是由于环境温度导致体温升高，升高的体温提高了代谢率。因此，环境温度高于热平衡区比低于它使动物的应激反应更强烈。,环境因素方面,湿度,Ringtail: Low environmental humidity, high temperatures, and drafts predispose young rats and mice to develop annular constrictions of the tail and occasionally feet or digits. Localized edema can lead to dry gangrene and tissue sloughing.,环境因素方面,噪声（Noise）,噪音是实验动物发生应激反应的常见原因。引起动物紧张，导致不安和骚动。国家标准60 dB超过100dB的噪声，能够引起某些品系的小鼠、大鼠和仓鼠发生抽搐；能够引起动物心跳、呼吸次数增加，引起大鼠血液甘油三酯水平升高和血压升高，而血糖降低；,环境因素方面,一个笼子中可以放多少只动物？ 经验告诉我们是每笼2-5只动物变异最低，动物单笼饲养变异高，当每笼动物数量超过5只时变异同样迅速攀升。,饲养密度每笼动物数（Number of animals per cage）,环境因素方面,饲养密度,环境因素方面,饲养密度,身处狭小笼中，实验小鼠精神失常。 英国和瑞士的研究人员曾安装一台24小时监控的摄像机，记录了实验小鼠的一举一动。老鼠们反复地做着同一动作。其中有些老鼠沿着笼子的不锈钢毫不费力地爬到顶部，前腿挂在天花板上，嘴则咬住笼栏，而后又跳到笼子底部。而另一只老鼠则在不停地翻跟斗，每秒钟一个，一口气能翻40分钟。它们每一个动作的目的就是为了不停地重复整套动作，而且做得那么认真执著，与精神病人的表现一模一样，毫无二致。,环境因素方面,势力范围,Male mice will fight when first co-mingled in a cage, and they need to be observed very closely during this time of establishing a social dominance hierarchy within the group. Weak and non-aggressive animals might be injured or killed if not removed from the cage.,环境因素方面,大多数动物已经形成了对人类的不信任，倾向于逃离人类。经过小心的捉拿操作和逐渐的适应，动物能够在某种程度上学会调整其逃走的本能。粗暴的捉拿操作和新的员工可再激活动物逃跑的本能，并可能影响到实验结果。,环境因素方面,Factors influence animal experiment, sensitivity and reproducibility,动物实验基本技术,主要内容,抓取与固定编号方法给药方法采血方法麻醉方法处死方法职业安全无害化处理,Animal Restraint,Mouse-Avoid grasping and pulling the tip of the tail,Rat,Tail should be lifted only at the base and for short period,tail skin may tear,Restrainer of Mice and Rat,Guinea pig,Hold with two hands,Rabbit,Use two hands for lifting and should not be restrained by the ears,Restrainer of Rabbit,Dog,性别鉴定,Fur coloring-picric acid,染色法：一般适用于短期实验，大小鼠常用。原则：动物背部朝上 头顶 1、右前肢2、 右侧腰部3、右后肢4 、 尾跟部5、左后肢6、 左侧腰部7、左前肢8、 背部9、不标号0或10 后面的数字永远大于前 面的数字，如12、23、56、 89、123、345等等；而 没有11、21、43、65等等。,Ear punching,金属耳号,玻璃管动物标记(微芯片microchip)）,1、可以标记的动物种类多2、体内标签，不易破坏3、使用寿命长，达到20年,可循环使用4、准确率高，读错率为10万分之一5、可以准确标记每一个动物,动物标签编码规则,3位国家代码+3位地区代码 +12位动物标签编码如： 国码：720 区域：899 序号：075733300002,玻璃管动物标签,玻璃管动物标签注射器,注射（植入）标签前一定要保证消毒到位，以避免不必要的感染,玻璃管动物标签阅读器,注射（植入）标签时应15-45度角注射，方便阅读器以之发生电磁感应，敏捷地读出数据。玻璃管动物标签阅读器的最佳阅读距离为7-12CM，不要太近或太远,纹身,皮下注射,腹腔注射,肌肉注射,Vein Injection of Mouse,Vein Injection of Rabbit,Vein Injection of Dog,Gavaging Method of Mouse,Gavaging Method of Rabbit,Injection volume in milliliters,Animal SC IM IV IP Rat 5-8 0.3 0.5 5-10Mouse 2-3 0.2 0.05 2-3Hamster 3-4 0.1 0.3 3-4G. P. 5-10 0.5 0.5 5-8Rabbit 30-50 0.5-1 1-5 50-100,人与动物的给药量换算方法,人与动物对同一药物的耐受性相差很大。一般情况下，动物的耐受性比人大，也就是单位体重动物的用药量比人要大。一般可按下列比例换算：人用药量为1；小鼠、大鼠为25-50；豚鼠、家兔为15-20；犬、猫为5-10。,Bleeding,Requiring anesthesiaCardiac punctureJugular veinPosterior vena cavaLateral saphenous vein (GP),Not requiring anesthesiaOphthalmic venous plexusTail veinEar veinCephalic vein (rabbit, dogs, cat)Lateral saphenous veinToe & tail cliping,Bleeding (cont.),Maximum amount of blood that can be safely removed for blood collection = 1% of body weight.Total blood volume is approximately 6% of body weighte.g.5 kg rabbit X 1% = 50 ml bloodAnimal produce 0.75-1.0 ml/kg/day of blood5 kg rabbit, 1ml/kg = X ml/5kg, X = 5 ml/dayIt will takes 10 days for the animals to replace the 50 ml that were with drawn,Ophthalmic venous plexus,Cardiac puncture,实验动物的采尿方法,代谢笼法：能将尿液和粪便分开而达到收集动物尿液目的的特殊装置。适用于大、小鼠。导尿法：适用于雄性兔、犬等。,实验动物的麻醉(Anaesthesia),动物麻醉目的：消除动物手术疼痛，便于实验操作，保证动物安全，为手术创造良好的条件。麻醉的意义：第一是善待动物，第二是提高动物实验的 效率。,全身麻醉：,局部麻醉：（普鲁卡因、利多卡因等）,挥发性麻醉剂：吸入给药乙醚、氯仿等非挥发性麻醉剂：静脉、皮下、肌肉、腹腔给药氯胺酮、戊巴比妥钠等,Anaesthesia Apparatus,实验动物的安乐死(euthanasia),指以人道的方法处死动物的过程。处死过程中尽量减少其惊恐和焦虑，使其安静地无痛苦的死亡。 安乐死必须符合的标准： 1.死亡时尽可能减少惊恐、疼痛。 2.使其在最短时间内失去意识迅速死亡。 3.方法可靠且可重复。 4.对操作人员安全。 5.采用的方法要与研究的要求和目的一致。 6.对观察者和操作者的情绪影响最小。 7.对环境污染的影响最小。 8.需要的机械设备 简单，价廉，易操作。 9.处死动物的地点应远离并与动物房分开。,Euthanasia (cont.)-Rodents,AcceptableInhalant anesthetic overdoseCOCO2Barbiturate overdoseMicrowave irraditation,Conditionally acceptableN2 (sedated or anesthetized) ArgonCervical dislocation (BW200g)Decapitation,Euthanasia (cont.)-Unacceptable,Humane concernsDecompressionDrowningStrychnineFor use in conscious animalsExsanguinationRapid freezingAir embolism,Sole methodNicotineMagnesium sulfatePotassium chlorideAll curariform agentsStunningHazardous to humansChloroformCyanide,常用脊椎动物安乐死方法,说明：O:建议使用方法；N:不得使用方法；M:一般情况不推荐使用，除非实验需要。,Occupational Health and Safety Program for Personnel with Laboratory Animal Contact,Risk Assessment:AllergiesBites and ScratchesSharps injuries (punctures, cuts, etc.)Chemical ExposureZoonotic Disease,Respiratory Protection,SHARPS,If needles are used, needles are not to be purposely bent or broken by hand, removed from disposable syringes or otherwise manipulated by hand.Needles should not be recapped unless absolutely necessary. If needles must be recapped, a single-handed technique should be used.,SHARPS,For sharps that pose a definite puncture potential, an approved sharps container is a puncture and leak resistant container (i.e., a red sharps container).,Memorial Tower for Laboratory animal,如何做好动物实验？,1、 明确目的及必要性 首先要弄清其目的是什么,动物实验也不例外。只有明确动物实验的目的,才能避免实验的盲目性,真正做到有的放矢,少走弯路,节约经费和时间,从而达到科学、节俭和高效。2、 确认必要性 “3R”原则 动物实验伦理和动物福利3、作好实验设计 对照原则 随机化原