HPLC定量分析方法

,HPLC法,高效液相色谱法,High performance liquid chromatography (HPLC),了解HPLC色谱仪的构成熟悉HPLC法分类及方法掌握HPLC法的定义、特点掌握HPLC法实验条件的选择掌握HPLC法的定量分析方法,教学大纲,用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入进样阀的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。,HPLC法的定义、特点,一、定义,二、特点,1.适用范围广（可分析80%有机化合物）2.分离性能好3.分析速度快4.灵敏度高5.色谱柱可反复使用6.流出组分容易收集,2006,Baidu 免责声明 与百度对话,HPLC实验条件的选择,1. HPLC前处理2. 色谱柱的选择3. 流动相的选择4. 洗脱方式的选择5. 检测器的选择,HPLC前处理,1. 流动相的处理2. 样品的处理,流动相的处理,1. 溶剂的纯化2. 流动相脱气3. 过滤,4. 色谱纯试剂5. 重蒸水,流动相的处理,过滤：除去固体微粒,亲水、亲脂、两用；0.45m,流动相的处理,流动相脱气,脱气：除去流动相中的空气方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、抽真空、加热脱气、在线脱气系统,样品的处理,除去杂质、纯化样品浓缩样品或进行衍生化过滤,HPLC前处理,样品的处理 供试品溶液的制备,提取,纯化,浓缩 or 衍生化,HPLC样品,处方,剂型,待测成分的理化性质,干扰成分的理化性质,色谱柱的选择,根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度,色谱柱的长度与分离效果,正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱，以正己烷系列为流动相。正相色谱法主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质,色谱柱的分类,反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机碳链。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。 反相色谱法适用于非极性及中等极性化合物目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱 最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基键合相）,色谱柱的分类,键合相的优点,使用过程不流失化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质热稳定性好，一般在70以下稳定载样量比硅胶约大一个数量级适于作梯度洗脱,避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱（如分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解）流动相要适宜，不能对固定相产生破坏注意色谱柱的pH使用范围、耐压限度注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲（除非指明）,色谱柱的使用和维护,每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗保存色谱柱在合适的溶剂中（应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。）,色谱柱的使用和维护,流动相的选择,固定相一定时，流动相的种类、配比、pH值及添加剂等能显著影响分离效果，HPLC中流动相的选择至关重要。,对流动相的基本要求,不与固定相发生化学反应对样品有适宜的溶解度 要求容量因子k在25 (最佳) 或110 (可用) k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀必须与检测器相适应 例如用紫外检测器时避免末端吸收粘度小,容量因子(capacity factory):也称为分配容量（partition volume）、容量比（capacity ratio），是在达到分配平衡后，组分在固定相中的量与流动相中的量之比。也称为质量分配系数。,流动相的选择,反相键合相色谱正相键合相色谱反相离子对色谱,键合相色谱法：化学键合相为固定相的色谱法，分离机制以分配作用为主，对不封尾的键合相还有一定的吸附作用。应用最广泛的色谱法,用化学反应将键合相的载体硅胶的残存硅醇基去掉的方法，称为封尾或遮盖（end-capping）,形成的键合相称为封尾键合相。,反相键合相色谱流动相的选择,1.部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃） 适用于分离中等极性、弱极性药物 常用甲醇水、乙腈水系统 有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响,反相键合相色谱流动相的选择,2.缓冲溶液常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组分的保留值,注意,由于C18链在水相环境中不易保持伸缩状态，故对于C18为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定,反相键合相色谱流动相的选择,3.非水溶剂流动相为不含水系统。用于分离疏水性物质。在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称为非水反相色谱法。,正相键合相色谱流动相的选择,流动相采用饱和烷烃（如正己烷）中加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度。,反相离子对色谱流动相的选择,是极性较强的水系统混合溶剂最常用的是甲醇水、乙腈水中加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂离子对试剂的性质、浓度、流动相的PH及流动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的保留值和分离效果,洗脱方式的选择,等度洗脱梯度洗脱,1洗脱的类型等度洗脱 在一个分析周期内流动相的组成保持恒定 适合于组分数目较少、性质差别不大的样品,洗脱方式的选择,葛根芩连汤中葛根素的含量,流动相: 甲醇：乙腈：水(12880)流速: 1.0 mL/min 柱温: 室温,1、洗脱的类 梯度洗脱 在一个分析周期中，程序控制流动相的组成改变（如溶剂的极性、离子强度、pH值等），使每个组分都在适宜的条件下获得分离。 适合于组分数目较多、组分间k值相差较大（10-100倍）的复杂混合物,洗脱方式的选择,优点 缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。使峰变尖锐，使微量组分容易被检出，提高检测灵敏度缺点 常常会引起基线漂移，重现性较等度洗脱差,2、梯度洗脱的特点,梯度洗脱的特点,标准品,样品,HPLC梯度洗脱条件,1.要注意溶剂的互溶性，不相混容的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相2.所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性3.混合溶剂的粘度常随组成而变化4.每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10-30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡,2、梯度洗脱的特点,梯度洗脱需注意内容,检测器的选择,分 类,1.紫外检测器（ultraviolet detector;UV)2.荧光检测器（fluorophtometric detector;FD)3.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector; ELSD)4.电化学检测器（electrochemical detector；ECD)5.示差折光检测器（differential refractive index detector；DRID）6.化学发光检测器（chemiluminescence detector;CLD)7.质谱检测器(mass spectrometry detector;MSD),检测器的选择,1.优点灵敏度高，最低检出量可达10-710-12 g 不破坏样品，可用于制备 对温度及流动相波动不敏感，可用于梯度洗脱,紫外检测器（最普遍）,2.缺点只能检测具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的 物质流动相的截止波长必须小于检测波长,紫外检测器（最普遍）,3.种类可变波长紫外检测器（UVD）配制最多,光电二极管阵列检测器 （photodiode array detector; PDAD或DAD）,紫外检测器（最普遍）,特点 可以快速扫描被测组分的的紫外可见吸收光谱。可以同时获得样品的色谱图及每个组分的吸收光谱。特殊功能 a、色谱峰的准确定性 b、峰纯度检验 c、多通道检测 d、峰抑制 e、宽谱带检测 f、选择最佳波长,光电二极管阵列检测器,a、色谱峰的准确定性 先取得该峰的光谱图,再与标准样品的光谱图进行比较,若两个光谱完全重合,说明是同一种物质;若不重合,说明是不同种物质。,光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器,b、峰纯度检验 在色谱分析中,通常利用吸收比确定峰的纯度。二极管阵列检测器既可使用吸收比的方法,又可使用比较光谱的方法。在峰的前沿、后沿和最大值处各取一点,扫出这三点的光谱图进行比较,若三个光谱图完全重合,说明是纯峰(只含一种物质) ,若不完全重合,说明峰中含有杂质。,对于任何在紫外-可见光区有吸收的纯物质在两个选定波长下的吸收比为一常数，且与浓度无关,d、峰抑制 如果两种化合物没有完全分离,但它们的光谱图有很大差别,就可以通过选择合适的测量波长、参考波长和带宽,使一种化合物被完全抑制。,光电二极管阵列检测器,1.优点灵敏度极高，比紫外检测器高一个数量级良好的选择性线性范围较宽受外界条件影响较小只要选作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯度洗脱高灵敏度和高选择性，适于体内药物分析,荧光检测器,2.缺点只适于检测能产生荧光或衍生物能产生荧光的物质。应用不如紫外检测器广流动相不能含有荧光物质或使荧光熄灭的物质,应用：氨基酸、多环芳烃、甾体化合物、酶,荧光检测器,蒸发光散射检测器,色谱柱后流出液（流动相+组分）先引入已通气体（常用高纯氮或空气）的雾化器，流出物与通入的气体形成均匀的微小液滴，经过蒸发器（漂移管）加热，蒸发除去流动相，而样品组分在蒸发器内形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶而产生光散射（丁铎尔效应），用光电二级管检测散射光强度，从而获得组分的浓度信号。散射光强度的对数与组分质量的对数成线性关系。,蒸发光散射检测器,1.优点通用型检测器。对各种物质几乎都有响应灵敏度比示差折光检测器高流动相系统温度变化影响不敏感可进行梯度洗脱没有流动相的紫外吸收干扰,蒸发光散射检测器,2.缺点分析范围受样品组分和流动相挥发性的限制流动相中如含缓冲溶液，缓冲溶液必须受到限制：必须是挥发性，并且浓度应尽可能低，不能用含缓冲盐的流动相。通常选用的缓冲溶液有：甲酸、乙酸、三氟乙酸等是一种破坏型检测器，不能配备制备型的高效液相仪进行样品的纯化制备比紫外检测器灵敏度低,蒸发光散射检测器,3.在中药分析中的应用中药的化学成分复杂，有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收。紫外检测器难于检测。ELSD在某种程度弥补了这方面的不足用于糖类、氨基酸、甾体等化合物,黄芪：黄芪甲苷，200.8nm末端紫外吸收,蒸发光散射检测器,电导检测器：用于离子色谱极谱检测器库仑检测器安培检测器,电化学检测器,伏安检测器,能氧化、还原的物质,检测限达10-12 g /ml，痕量组分分析,特点：通用型检测器对多数物质的灵敏度低（约10-5 g /ml），不能用于痕量分析适合于糖类的检测（检测限可达10-8g /ml）受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱,示差折光检测器,高选择性、高灵敏度的新型检测器是分析微量脂质、核酸、生物胺的最佳选择,化学发光检测器,HPLC-MS能提供的质谱信息准确的化合物分子量信息未知化合物碎片结构信息一套完整的图谱和多种扫描方式充分提供定性、定量和峰纯度信息可用于无共价键、无功能团的化合物,质谱检测器,几种检测器的主要性能,化学键合相色谱法 BPC（最广泛）胶束色谱法 MC手性色谱法 CC,HPLC法分类及方法,借助于化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体的表面而构成化学键合相。,化学键合相色谱法,反相键合相色谱法正相键合相色谱法离子对色谱法离子抑制色谱法,反相键合相色谱法,适用于非极性与中等极性的化合物非极性键合相：十八烷基键合相是最常用的固定相（ODS) 05版药典一部流动相：水+极性调节剂,正相键合相色谱法,适用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。如：酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等常用的极性键合相：氰基（CN)、氨基（NH2)和二醇基(DIOL) 常用的流动相：烷烃（常用正己烷）+极性调节剂极性调节剂：乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等,氰基键合相：分离选择性与硅胶相似，对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好选择性氨基键合相：较强的氢键结合能力，对含有甾体、强心苷等官能团的化合物有较好的分离能力；与糖类分子的羟基产生选择性。 氨基柱用作分析糖类的专用色谱柱，但不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等。因为存在Schiff碱反应。,正相键合相色谱法,含义：直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物的方法称为离子对色谱法。分类：反相离子对色谱法;正相离子对色谱法反相离子对色谱法：以C18或C8键合相为固定相，含离子对试剂的有机溶媒水溶液为流动相适用于有机酸、碱、盐的分离,离子对色谱法,1.离子对试剂的选择：选用的离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。 分析碱类或带正电荷的物质：用带负电荷的烷基磺酸盐或烷基硫酸盐 如：己烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等 分析酸类或带负电荷的物质：用带正电荷的季胺盐 如：四甲胺、四丁胺、十六烷基三甲胺、三辛胺等 离子对试剂的浓度一般为：3-10mmol/L,反相离子对色谱法,2.流动相ph值的控制调节ph值可在较大范围内改变弱酸、弱碱样品的保留值和分离选择性 因采用的是以硅胶为基体烷基键合相，流动相的ph应在2-8范围内调整3.有机溶剂的选择：甲醇水；乙腈水系统,反相离子对色谱法,反相离子对色谱法特点,采用反相键合液相色谱柱，在一般的HPLC仪器上就可运行，它兼有反相色谱和离子交换色谱共同的优点，分析速度快，效率高，操作简便。适用于有机酸、生物碱的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离。缺点：离子对试剂价格较贵。,离子抑制色谱法,定义 通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）、或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的pH值，抑制组分的离解，增加组分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以达到分离有机弱酸、 弱碱的目的。这种技术叫离子抑制色谱法。,离子抑制色谱法通常用于反相键合相色谱中，组