SEM样品处理方法.doc

Electron microscopy. Exponential-phase cultures of different M. smegmatis strains were harvested, washed three times with 0.15 M cacodylate buffer, treated with 1% osmium tetroxide for 1 h at room temperature, centrifuged, and the collected cells were fixed with 0.15 M cacodylate buffer containing 2% glutaraldehyde for 2 h at room temperature. Cells were again collected after centrifugation and fixed overnight with 0.15 M cacodylate buffer containing 1% osmium tetroxide at 4 . The cells were dehydrated using graded ethanol (10 %, 30 %, 50 %, 70% and 100 %), mounted on microscope stubs and sputter coated on the sputter coater. The samples were then examined under a Leica S440 scanning electron microscope.2.5. Scanning electron microscope(SEM) For SEM analysis, cells were fixed with2.5%(v/v) glutaraldehyde for 23 h. The fixed cells were washed with 0.1Mphosphate- buffered saline(PBS)(pH7.3) for three times(10mineach). Subsequently, ethanol concentration gradient(v/v)of 50%,70%, 80%, 90%and100%was used to dehydrate the fixed cells in a sequential way. Finally, the resulted cell samples were further dehydrated by two more100% ethanol treatments. After that, tertiary butyl alcohol mixed with ethanol in a ratio of 1:1and pure tertiary butyl alcohol was applied to achieve metathesis of ethanol in the cells. At last, cells were mixed in tertiary butyl alcohol and lyophilized for imaging.2.4.2. Electronmicroscopyanalysis Cells were harvested by centrifugation at 5000g for 3min, washed three times with PBS(phosphatebufferpH7.2).Subsequently, the cells were fixed with 2%glutaraldehyde(pH7.2)at room temperature for 2h and washed again as above. The cells were prepared for scanning or transmission electron microscopy as described previously (Denner etal.,1994).真空扫描式电子显微镜 JSM-6360LV扫描电子显微镜03040702-0020S-3400N二、扫描电子显微镜扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。要有s-4800扫描电镜看细胞形态，谁知道怎么处理样品啊？是发酵液中的菌体学固定液，滤纸分离，酒精梯度脱水，干燥， 电镜实验室送检。扫描电镜样品前处理弧菌的电镜实验，曾经做过一次，按照下面的步骤做的，但是效果不好，细菌拍下来不立体。将菌液以3000r /min转速离心10min后，弃上清液。注入 2.5%戊二醛，静置2h以上固定。固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以蒸馏水重悬浮，重复3次，最后以蒸馏水重悬。分别用30%、50 %、70 %、80%、90%梯度浓度酒精脱水，每个梯度中静置 10min，脱水完毕，用纯酒精脱水 3次，每次30min，然后用纯叔丁醇置换酒精3次, 每次30min，最后吸取混匀的细菌-叔丁醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，置冷冻干燥机内真空干燥。 有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？416114799(站内联系TA)按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h磷酸缓冲液洗涤 3 次乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后经 8000 r/min 离心 5 min。将样品分别在 20、40和80冷冻 12 h，于冷冻干燥仪中干燥12 h，备用。我是这么做的。根据你的描述，有以下问题：戊二醛固定时间不够；洗涤液不能用水，必须用磷酸缓冲液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分别溶于1 L水中，然后将二者按照7:3的体积比混合（V:V），就可以了。）；不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛应该用以上的PBS来配置；酒精梯度脱水，顾名思义就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%来脱水是不行的，因为浓度太高，细胞形态就严重变形；按照我的这个梯度，我做出来非常漂亮； 在冷冻干燥前，必须把脱去自由水的样品按照从-20-40-80的梯度冷冻，目的把结合水固定住，梯度原理与相同；乙酸异戊酯的目的是置换掉乙醇，该药品神经毒，请在通风橱进行，不过只是有机物而已，偶尔接触没关系，不用怕。凡药品都有毒的。无法附图片，不然给你看看我拍的。希望对你有帮助。416114799(站内联系TA)补充一下：PBS也是保护细胞形态的，原理你应该懂得。416114799(站内联系TA)“有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？”这个肯定都要倒掉的啊？Ni都留着，然后继续加下一个？不要吓我。每一步，不仅仅是乙醇脱水这个，全都要弃上清啊。我滴妈呀416114799(站内联系TA)6楼:Originally posted bylovestringsat 2012-09-06 13:37:47前辈，我的细菌样品如果处理好，4天后才能拍电镜的照片，会不会影响结果？如果不影响，我是放在-80里保存4天呢，还是放在-20呢？谢谢啦.处理好了就是冷冻干燥了，这才叫处理好。如果还没条件冷冻干燥那就可以现在-80放着，要冷冻干燥了再拿去干燥。如果你是冷冻干燥后，要保存，只能放在有干燥剂的地方，如果你这个也不知道就没法指导了。好像你很多都不知道啊？说得也不清不楚，我往往要两头解释。lovestrings(站内联系TA)7楼:Originally posted by416114799at 2012-09-06 14:01:22处理好了就是冷冻干燥了，这才叫处理好。如果还没条件冷冻干燥那就可以现在-80放着，要冷冻干燥了再拿去干燥。如果你是冷冻干燥后，要保存，只能放在有干燥剂的地方，如果你这个也不知道就没法指导了。好像你很多都 .我只不过想早点把样品处理好，我们学校里的电镜实验做起来要排队，我怕样品处理好了，不能保存，细菌会变形。你的意思就是不能马上做电镜实验，就先-80度冻起来，要拍电镜照片之前的12小时去冷冻干燥，省的干燥完了不能马上做实验，又吸潮了呗humourhy(站内联系TA)8楼:Originally posted by416114799at 2012-09-06 14:02:51冷冻干燥的目的一是出去结合水，使电镜时不会被干扰。还有就是为了形态稳定，毕竟在处理过程中有了固定化的步骤。你还是好好理解下各个步骤的原理吧.您好我是在多孔聚酯支架上种细胞，然后放在SEM下观察准备按照您提供的固定脱水细胞的方法来试一下我想请教下您两个问题:P 乙酸异戊酯替换乙醇这一步是不是决定性的一步呢，因为我的高分子支架很可能就被溶解了，所以这一步不做是否有实质性的影响？最后一步干燥过程，因为我们实验室的冷冻干燥剂不能控温，所以做不到您提供方法如此精细的冷冻干燥，所以我在想，直接在梯度脱水后室温下风干或者真空干燥是否可以呢？非常期待您的解答:hand:)416114799(站内联系TA)11楼:Originally posted byhumourhyat 2012-09-29 10:25:35您好我是在多孔聚酯支架上种细胞，然后放在SEM下观察准备按照您提供的固定脱水细胞的方法来试一下我想请教下您两个问题:P乙酸异戊酯替换乙醇这一步是不是决定性的一步呢，因为我的高分子支架很可能就被溶解了 .可以的哦，其实置换只是为了把乙醇除去，其实乙醇本来就很容易挥发的。我师姐做过没有用乙酸异戊酯置换的，效果也可以的啊。不影响哦humourhy(站内联系TA)12楼:Originally posted by416114799at 2012-09-30 08:31:31可以的哦，其实置换只是为了把乙醇除去，其实乙醇本来就很容易挥发的。我师姐做过没有用乙酸异戊酯置换的，效果也可以的啊。不影响哦.soga非常感谢:hand:哇哈哈VS可乐(站内联系TA)你好，我想问一下，我的样品有容易跟PBS反应的CU，我要用什么东西去清洗样品好你好，我现在在做SEM的预处理，我想问一下，我的样品容易跟PBS反应，我要怎么处理。哇哈哈VS可乐(站内联系TA)3楼:Originally posted by416114799at 2012-09-03 20:18:12按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h磷酸缓冲液洗涤 3 次乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）乙酸异戊酯置换乙醇2 次（20 min/次），每一 .扫描电镜前样品预处理416114799(站内联系TA)16楼:Originally posted by哇哈哈VS可乐at 2012-11-06 08:29:58扫描电镜前样品预处理.我的这个处理方法只是针对微生物，PBS是起缓冲液作用，不至于细胞变行之类的。我不知道你要处理什么样品呢？哇哈哈VS可乐(站内联系TA)17楼:Originally posted by416114799at 2012-11-06 09:26:56我的这个处理方法只是针对微生物，PBS是起缓冲液作用，不至于细胞变行之类的。我不知道你要处理什么样品呢？.因为我的样品上面有单质铜，如果用PBS就会有产生磷酸铜沉淀。416114799(站内联系TA)18楼:Originally posted by哇哈哈VS可乐at 2012-11-08 08:43:38因为我的样品上面有单质铜，如果用PBS就会有产生磷酸铜沉淀。.如果你也是微生物的，用缓冲液按理是必须的，否则就会变形，但是如果你对微生物