染色体结构变异(SV)与NGSPPT课件.ppt

染色体结构变异 SV 与NGS 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 SV的概念 Structuralvariation SV isanumbrellatermusedtodenotemedium scaledifferencesfoundbetweengenomesofindividualswithinacertainspecies Usually small scaledifferences suchassingle nucleotidevariants SNVs andshortinsertions deletions indels 50bp andlarge scaledifferences suchaschromosomeduplication areconsideredasseparatecategories SV的概念 Structuralvariation SV isgenerallydefinedasaregionofDNAthatshowsachangeincopynumber deletions insertionsandduplications orientation inversions orchromosomallocation translocations betweenindividuals SVcanbebalanced withnolossorgainofgeneticmaterial suchasinversionsofageneticfragmentortranslocationsofastretchofDNAwithinorbetweenchromosomes orunbalanced whereapartofthegenomeislostorduplicated whichistermedcopynumbervariation CNV Chromosomalaneuploidieswouldbe infact extremecasesofunbalancedSV 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 SV的分类 SV的分类 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 SV的形成机制 recombinationerrors inparticularnon allelichomologousrecombination NAHR errorsgeneratedinDNAbreakrepair asinnon homologousendjoining NHEJ microhomology mediatedendjoining MMEJ errorsinreplication suchasforkstallingandtemplateswitching FoSTeS Microhomologymediatedbreak inducedreplication MMBIR serialreplicationslippage SRS Mobileelementinsertions MEI mostlyfromtheAlu L1andSVAfamilies 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 SV的影响 到目前为止 并非所有的SV都会导致疾病 只有一小部分已知的SV跟疾病相关 UnbalancedSV会导致CNV 由此带来的基因剂量效应可能会导致一些神经发育性疾病 如智力障碍 自闭症 精神分裂等 SV还会导致融合基因 融合基因会与一些疾病相关 SV断点的位置效应会影响基因的表达 SV对检测技术提出了更高的要求 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 染色体显带技术 chromosomebanding 用染料如Giemsa对分裂期的细胞进行染色 显示染色体条带 在显微镜下观察 可检测大的染色体变异 对于较小的结构变异观察不到 荧光原位杂交 Fluorescenceinsituhybridization FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术 其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素 地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体 细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交 经变性 退火 复性 洗涤后即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体 直接检测或通过免疫荧光系统检测 最后在荧光显微镜下显影 即可对待测DNA进行定性 定量或相对定位分析 主要优势 安全 快速 灵敏度高FISH可定位长度在1kb的DNA序列可检测拷贝数变异 基因融合主要缺点 需要活细胞相对于NGS 一次的检测的位点数有限 bcr ablrearrangement associatedwithchronicmyelogenousleukemia 微阵列比较基因组杂交 arraycomparativegenomichybridization aCGH 微阵列比较基因组杂交 arraycomparativegenomichybridization aCGH 技术是在CGH技术基础上发展起来的新的染色体病诊断技术 仅需少量的DNA即可系统地检测整个基因组DNA的扩增或缺失 与传统的核型分析相比 ArrayCGH不需要细胞培养 分辨率高 操作简单 自动化程度高 且软件分析结果减少了人为主观因素产生的误差 ArrayCGH分辨率能够达到0 05Mb 可以检测到一些核型分析检测不到的染色体的微小缺失或重复 是研究整个基因组缺失或重复的非常有应用前途的分子细胞遗传学技术 ArrayCGH被美国人类遗传学杂志推荐为不明原因发育迟缓 智力低下 自闭症 多发畸形的首选遗传学诊断方法 SNP芯片 SNParray SV的NGS检测原理 NGS检测程序 CNV检测 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 融合基因的定义 Afusiongeneisahybridgeneformedfromtwopreviouslyseparategenes 基因融合机制 Breastcancerassociatedread throughfusiontranscripts cis splicing Thegenerationofchimericgeneproductsbytrans splicingofRNAandbygenefusion 目录 SV的概念SV的分类SV的形成机制SV的影响SV的检测方法SV与融合基因融合基因的检测方法 RNAisbetterforfusiondetectionthanhybridcapture STAR Fusion simulateddata cancercelllinetranscriptomes IonAmpliSeq RNAFusionLungCancerResearchPanel 检测基因 EML4 ALK13种 Kif5b ALK3种 KCL1 ALK1种EZR ROS11种 GOPC ROS12种 LRIG3 ROS11种 SCD4 ROS14种SCL34A2 ROS12种 TPM3 ROS11种 CD74 ROS12种KIF5B RET7种 CCDC6 RET1种总计38种融合 设计思路 1 融合点外显子区域设计引物 发生融合则有counts产出2 融合基因的5 3 区各设计一对引物 用作基因表达水平分析3 融合频率计算 IonAmpliSeq RNAFusionLungCancerResearchPanel 普通的建库方法 没有设计分子标签 单端200SE测序 最低10nginputFFPERNA IonAmpliSeq RNAFusionLungCancerResearchPanel 分析策略 1 去接头 去小片段2 3 端比对至5 驱动基因 ALK ROS1 RET 即驱动基因比对3 比对至融合参考序列及内参基因4 两次分析 一次去除小于40nt 第二次去除小于90nt 内参基因counts存在变化 融合RNA比例梯度实验 使用两种RNA 即HBR humanbrainreferenceRNA 和H2228CelllineHBR没有基因融合 H2228存在EML4 ALKFusion3 4两种融合按质量比设置融合RNA占比为50 15 5 1 四个模板梯度InputRNA为10ng Qubit定量 IonAmpliSeq RNAFusionLungCancerResearchPanel ALK 3P NM 004304 4 e23e24ALK 5P NM 004304 4 e5e6RET 3P NM 020975 4 e18e19RET 5P NM 020975 4 e6e7ROS1 3P NM 002944 2 e38e39ROS1 5P NM 002944 2 e11e123P 5P的设计区域 存在较多白点未扩增 内参基因 5个HMBS TBP ITGB7 MYC LMNA作用 检测FFPERNA降解程度其他功能 未知 TheIonAmpliSeq RNAlungfusionpanelshows Robustperformancefromall5RNAqualitycontrolassaysfromlowtotalRNAinput 10ng andfromdegradedRNAisolatedfromformalinfixedparaffinembeddedtissue RIN97 37 concordance AmpliSeqvsArcherFusionPlex ArcherFusionPlex介绍 nCounter GeneFusionPanels nanostring ProbeA为融合杂交探针 有独有的RepoeterTag标记 分析时产生特有信号 仪器可识别这些信号 并根据信号强弱 检测其融合片段数据 探针长度为100bpProbeB链接着Biotin 可根据biotin把这些片段分离出来 原理 工作流程 nCounter LungGeneFusionPanel ThenCounter LungGeneFusionPanelincludes63probes 35forspecificfusiondetection 24forpositionalgeneexpressionimbalancedetection and4internalreferencegenes 融合基因 主要为ALK ROS1 RET内参基因 GAPDH GUSB OAZ1 POLR2A SampleinputrecommendationsweredevelopedusingpurifiedtotalRNAfromavarietyoftissues ofwhichmRNAtypicallycomposes5 10 NanostringrecommendsevaluatingRNAqualityusingaNanoDrop orotherspectrophotometerandanAgilentBioanalyzer Foroptimalperformance RNAshouldexhibitanA260 A280ratioof1 7 2 3andanA260 A230ratioof1 8 2 3withamajorityofthesamplegreaterthan300nucleotidesrespectively nCounter LungGeneFusionPanel 基因表达监控点 每个融合基因3P 5P都有四条探针覆盖 长度都为100bp nCounter LungGeneFusionPanel nSolversoftware v4 0分析结果展示 TheFusionDetectionSummary Figure9 isasample genematrix color codedaccordingtowhetheragenetestedpositiveornegativeforevidenceofajunction relyingonasequentialoutliertestforJunctionProbedetection and orpositiveornegativeforevidenceofanEndProbeimbalance usingat testforoverexpressionofthe3 probe Thisfiguresummarizesthefusioncallsbyplottingeachgenetestedontheverticalaxisandeachsampletestedhorizontally Color seeplotkey indicateswhetherafusionwasdetectedandthetypeofevidenceusedtomakethecall