小麦组织培养的研究进展.doc

_小麦组织培养的研究进展摘 要：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证。在小麦组织培养中，几乎各种器官、组织均曾被用作外植体进行离体培养，比如小麦根、幼叶、种子、顶端分生组织、花药、原生质体、幼穗、成熟胚以及幼胚等。其中重点的对小麦幼胚和成熟胚等外植体通过不同组培体系最终获得再生植株的研究进展进行了综述，以期为小麦组织发生学、胚胎学、细胞工程及遗传操作等方面提供参考。关键词：小麦；外植体；组织培养；研究进展小麦是世界上分布范围和栽培面积最广，在中国种植面积仅次于水稻，是中国人民的主要粮食作物之一（奚亚军等，2002）。随着社会经济的发展及生活水平的提高，对其抗但在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。实践证明，利用植物基因工程（覃建兵等，2001）改良小麦品质是一行之有效的途径。虽然转化方法较多且日趋成熟，但限制其发展的一个重要因素是小麦的植株再生频率低，而且建立稳定的小麦再生体系也比较困难。所以，在小麦组织培养过程中，建立高频率的植株再生体系是小麦转化成功的重要基础和保证。本文重点对幼胚和成熟胚等小麦外植体的选择、处理方法、培养基的选择激素影响等方面作了扼要论述。1 外植体来源的选择外植体的来源即材料的来源，是细胞培养成功的关键之一。虽然植物体的所有细胞都含有相同的基因和具有全能性，但是由于细胞的分化结果在不同的组织、器官中基因的表达有所不同。1.1幼胚小麦幼胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要的意义。以幼胚为外植体进行小麦组织培养的方法被大多数学者认为是最有效的培养方式。有研究对小麦未成熟胚离体培养得到的再生植株，认为未成熟胚培养诱导和筛选无性系变异，可作为小麦品质改良的一种手段（胡尚连等，1998）。还有对3个品种(系)的研究，确立了小麦幼胚最佳取材时期的种子形态指标,为取材节省了大量时间，并大大减缓了接种压力（刘少翔等，2003）。王常云等人对15个小麦品种进行离体培养，结果诱导率达到了100%，得出品种间分化率有明显的差异（王常云等，1999）。小麦幼胚愈伤组织诱导率很高，通过对愈伤组织的直接或间接筛选，可以发生定向变异，主要体现在农艺性状（如株高等），抗性和品质方面，故小麦幼胚培养主要体现在新品种的选育上（于相丽，2009）。1.2幼穗以小麦幼穗为外植体进行离体培养获得全苗的试验已有报道。 与小麦幼胚相比较而言，幼穗具有取材范围大、利用率更高、周期较短、出愈率高、愈伤块大、容易灭菌和操作简单等优点（郎明林等，2001）。 除此之外，幼穗可不进行继代培养而直接转入试管进行分化培养，避免因继代培养造成污染而延长时间，从而缩短组培进程。因此，小麦幼穗也是良好的离体培养材料。1.3成熟胚实践证明，用小麦成熟胚作为外植体，可以保证不同的个体间生理状况相似，而且取材方便，不受季节限制，代价小，可大量获得。因此，已得到广泛的研究应用（彭朝华等，1989）。但其愈伤组织的形成及植株再生能力远远不及幼胚和幼穗，而且还存在有不少弊端。如伍碧华等报道，用成熟胚作外植体易被感染，感染率高达 50% 以上，且愈伤组织质量差，呈水浸状（伍碧华等，2001）。有等研究指出植物激素对于组织和细胞培养中的器官或胚状体形成具有重要的调节作用（贺杰等，2007）。而唐宗祥等实验初步证明了用成熟胚作为外植体进行组织培养进而获得转基因小麦的可行性（唐宗祥等，2001）。1.4其他外植体选取花药时，应取花药处于单核中晚期（外部形态为幼穗麦芒露出旗叶叶鞘）的穗子，从旗叶节下剪取。以往的研究表明，小麦花药培养的出愈率和绿苗分化率的高低主要与预处理和培养温度、品种的基因型、外植体的生理状态、培养基的成分等有关（倪胜利等，2004）。从叶片组织产生可再生的愈伤组织已在燕麦、黑麦、大麦等几种麦类作物中获得成功。麦类作物叶片细胞在离体培养条件下再生能力是很有限的，被认为是全能性很低的细胞。老的芽比幼嫩的芽难培养，休眠的芽几乎不能培养成功，老叶比幼嫩的叶子难培养。2000年，蔡润等用小麦根作外植体诱导愈伤组织并成功获得再生植株 ，填补了国内外小麦离体根培养再生植株研究的空白（蔡润等，2000）。由于小麦种子根生长快速，是最容易获得的外植体之一，所以利用离体根培养获得大量再生植株可为小麦育种提供广泛的遗传变异。2 常用外植体处理方法2.1幼胚取开花后1420d的小麦幼穗，剥出种子，70%乙醇消毒1min，无菌水洗涤1次，再用0.3%的NaClO消毒5min，无菌水洗35次，无菌条件下用镊子和解剖针将幼胚取出，盾片向下接种。2.2幼穗在小麦生长锥处于小穗分化期 (肉眼观察幼穗长度为1.0cm左右)前后，取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，保留含嫩叶部分在内的幼穗，用纱布包好，在超净工作台上用0.3%的NaClO溶液消毒8min，无菌水冲洗34次，小心剥去外围的叶鞘和幼叶，取出幼穗切段接种到诱导培养基上。2.3成熟胚小麦成熟种子浸种12h，经70%乙醇浸泡5min，无菌水冲洗58次，或70%乙醇浸泡1min，0.3%的NaClO浸泡20min，无菌水冲洗45次后在无菌条件下剥取胚，盾片向下接种。2.4花药在田间选取小麦花药处于单核中晚期的穗子，从旗叶节下剪取，装入广口瓶中带回，保存于24的冰箱中备用。在超净工作台上先用70%的酒精进行表面消毒，然后用0.3%的NaClO溶液消毒10min再用无菌水冲洗35次后接种。3 培养基的选择选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。在设计和选择培养基时，应当根据细胞的特性和要求，选择各种组分的种类和含量，以满足细胞生长、繁殖和新陈代谢的需要，并调节至适宜的pH值，主要考虑基本培养基和各种激素的浓度及相关比例。在对小麦胚愈伤组织及植株再生研究（赵元增等，2004）中，大部分都采用MS培养基，并且得知在品种分化的过程中不仅激素比例影响分化情况，而且培养基的基本成分对其他产生很大的影响。孙果忠等分别用含有2mg/L的2，4-D的HB培养基和N6培养基对25个基因型的小麦幼胚进行愈伤诱导和继代培养实验，结果表明：无论是组织的诱导还是继代，HB培养基均明显优于N6培养基（孙果忠等，1996）。在很大程度上，培养基成分制约着离体培养植物组织的生长和形态发生。虽然植物组织培养对营养的基本需要类似于完整植株，但事实上在不同的实验条件下和不同物种之间，培养组织最适生长所需要的营养成分变化很大。因此，应该根据不同的培养体系设计特殊的培养基配方。4植物激素对组织培养的影响组织培养中对培养物影响最大的是外源激素，在基本培养基确定之后，实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。在离体培养中常用的植物激素种类有4类，即生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸（ABA），这对植物的生长调节十分重要（赵占军等2003），常用赤霉酸和ABA。生长素和细胞分裂素的比例对组织培养体系的形态发生十分重要。对于胚胎发生、愈伤组织诱导和根诱导来说，生长素与细胞分裂素需要一定的比例。5问题与展望小麦组织培养的目的是为了获得大量的再生植株，所以提高植株再生率已成为小麦组织培养的关键性问题。由于外植体来源不同，它们的内源激素水平就不同，需要通过调节外源激素和改善培养条件来解决这个问题。同时，基因型也是影响小麦组织培养的重要因素。在小麦组织培养过程中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体，在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了其优点和不足之处。因此，以小麦愈伤组织诱导率和植株再生频率为标准，进行不同基因型及其外植体和培养条件的筛选及定位，在提供理想的转化受体材料、提高转化率、丰富遗传资源和改良品种等方面都具有重大的理论和现实意义。参考文献1奚亚军,路明.小麦转基因技术的研究现状及在育种上的应用J.中国农学通报,2002,18(2):55-57.2 覃建兵,何光源.不同小麦基因型及其不同外植体离体培养研究初探J.华中农业大学学报,2001,20(6):522-527.3 胡尚连,李文雄,曾寒冰.小麦未成熟胚离体培养的研究-再生植株后代籽粒醇溶蛋白和谷蛋白亚基及蛋白质含量变化J.作物学报,1998,24(4):202-212.4刘少翔,王卉,孙毅,梁宏,崔贵梅.小麦幼胚的脱分化状态及再生性能研究J.华北农学报,2003,18(1):64-67.5 王常云,王作全,李晓亮,王志新,周德强,卢建声,王丽辉.小麦离体培养育种技术研究J.麦类作物,1999,19(1):14-16.6 于相丽,孟军.小麦幼胚培养研究进展J.贵州农业科学,2009,37(7):13-15.7 郎明林,陈荣敏,赵建军,温书敏,杨学举.影响小麦幼穗组培效应的几个因素探讨J.植物生理学通讯,2001,37(5):393-395.8 彭朝华,毛炎麟. 小麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生J. 北京农业大学学报,1989,15(4): 397-401.9 伍碧华,郑有良,刘登才,周永红.四川小麦幼胚离体培养变异性及其性状的相关研究J.西南农业学报,2001,14(4):20-24.10贺杰,常景玲.小麦成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生体系的研究J.安徽农业科学,2007,35(5):1280-1281.11唐宗祥,任正隆,张怀琼,张怀渝,傅体华.小麦新品种 R59 成熟胚的组织培养初报J.四川农业大学学报,2001,19(4):398-399.12倪胜利,李唯,李胜,柴守玺,李志明.影响旱作小麦高效花药培养的因素J.甘肃农业大学学报,2004,39(2):141-145.13蔡润,中田和男,平井八十一.小麦根愈伤组织胚胎发育过程研究J.西北植物学报2000,20