人教版选修一 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件（28张）.ppt

多聚酶链式反应 polymerasechainreaction pcr技术 是一种在体外快速扩增特定基因或dna序列的方法 故又称为dna体外扩增技术 课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 a g c t 1 dna的基本单位 脱氧核苷酸 一 dna分子的结构 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 2 脱氧核苷酸的种类 腺嘌呤脱氧核苷酸 3 dna分子的平面结构 氢键 5 端 3 端 5 端 3 端 4 dna的立体结构 双螺旋结构 2 时间 细胞分裂间期 有丝分裂间期 减数第一次分裂的间期 1 概念 以亲代dna为模板 根据碱基互补配对合成子代在dna的过程 3 场所 主要是细胞核 其次是线粒体 叶绿体 二 细胞内dna复制的过程 4 条件 模板 亲代dna的两条母链 原料 游离的四种脱氧核苷酸 能量 atp 酶 解旋酶 dna聚合酶 引物 一小段rna 能与dna母链的一段碱基序列互补配对 5 过程 1 解旋 解旋酶 atp 2 以dna的两条母链为模板 根据碱基互补配对规则 合成子链 3 子链 母链螺旋构成子代dna dna体内复制 示意 6 复制特点 半保留复制 边解旋边复制 多起点复制 7 dna复制的方向 dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 1 pcr的技术 dna体外复制 的条件 dna双链 单链 变性 加热80 100 复性 缓慢冷却 一 pcr的原理 pcr的技术原理 一 pcr的原理 pcr的技术原理 时间 min 温度 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1 3步30轮 3 dna复制的方向 dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 2 步骤 变性 复性 延伸 pcr技术的原理总结 利用dna分子的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解旋与结合 从而完成体外dan分子的扩增 体外dna复制的条件 四种脱氧核苷酸 耐高温的dna聚合酶 引物 模板 缓冲溶液和严格控制温度的温控设备 复制的方向 子链的5 端向3 端延伸 二 pcr的反应过程 变性95oc 5 引物1 5 引物2 5 5 模板dna 25 30次循环 复制 后 模板dna的含量可以扩大100万 220 倍以上 每个循环包括 变性 复性 延伸 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也可以作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 这样 dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 pcr的反应过程总结 三 pcr反应的实验操作 1 pcr仪 设备及用具 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移pcr配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三 pcr反应的实验操作 1 按配方将所需试剂摆放在实验桌上 准备 2 用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分 移液 3 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 混合 4 将微量离心管放在离心机上 离心 5 将离心管放入pcr仪上 设置好pcr仪的循环程序 反应 四 结果分析与评价 dna含量的测定 稀释 对照调零 测定 计算 公式见p63 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 一 理论上dna扩增数目的计算 四 课题成果评价 1 一条dna 复制n次 dna为2n 2 a条dna 复制n次 dna为ax2n 二 实验中dna含量的测定 1 原理 可以通过测量dna含量来评价扩增的效果 dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna的含量有关 2 过程 稀释 2 lpcr反应液 加入98 l蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 取dna稀释液100 l至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 测定并计算 dna含量 g ml 50 260nm的读数 稀释倍数 50 在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1 dna的含量为50 g ml的 体内dna复制与pcr的技术区别 课堂小结 练习巩固 1 关于pcr技术的应用 错误的一项是a古生物学 刑侦破案 dna序列测定b诊断遗传疾病 基因克隆 古生物学cdna序列测定 基因克隆 刑侦破案 d诊断遗传疾病 合成核苷酸 dna序列测定 2 dna的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸 3 pcr技术最突出的优点是a原理简单b原料易找ctaqdna聚合酶有耐热性d快速 高效 灵活 易于操作 从子链的5 端向3 端延伸 4 做pcr使用的微量离心