细胞操作级别磷酸盐缓冲液(PBS)制备protocol.doc

细胞操作级别磷酸盐缓冲液（PBS）制备protocol PBS是组织细胞培养中常用的基本液体。它可以维持渗透压、调节pH值及细胞生存所需的无极离子成分，一般用于洗涤组织、细胞。【实验仪器】仪器名称仪器型号仪器品牌超净工作台SW-CJ-2FAIRTECH高压蒸汽灭菌器HVE-50HIRAYAMACO2培养箱3111Thermo显微镜CKX41Olympus超纯水仪Integral 3Millipore分析电子天平BSA224S-CWSartorius磁力搅拌器GL-3250B其林贝尔pH计PB-10Sartorius不锈钢过滤器双链球【实验试剂】超纯水，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾， NaOH（5M），HCl（1M），DMEM（10%FBS）。【实验耗材】玻璃皿（直径大于10cm），微孔滤膜（孔径大小0.22m和0.45m），500mL丝口瓶，包布，高压蒸汽灭菌指示胶带，2L烧杯，滤纸，2L量筒，保鲜膜，75%医用酒精，1mL蓝枪头，3.5cm皿，500mL量筒。【注意事项】1、实验试剂均为公用试剂，开始实验前请确保试剂足量。2、实验操作过程中应穿着实验服，佩戴口罩，PE手套，在超净工作台中操作时则应穿着无菌服，佩戴口罩，乳胶手套，手进入超净工作台操作前要75%酒精灭菌。3、高压蒸汽灭菌前须确保高压蒸汽灭菌器中的水量充足。4、高压蒸汽灭菌后取物品时需戴橡胶隔热手套，防止烫伤。5、过滤操作在C3号超净工作台内完成，避免影响细胞间其它正常实验操作。6、在超净工作台中的操作必须是标准的无菌操作。7、不锈钢过滤器在超净工作台中紫外灭菌的时间不宜过长，避免微孔滤膜风干造成过滤效率下降。8、清洗时拆开不锈钢过滤器需观察微孔滤膜是否破损，如若破损则本批次的PBS需重新过滤。9、本实验列出的药品用量是按制备2L磷酸盐缓冲液计算的，如需制备不同体积请注意换算。10、PBS配制时，2L液体分装到4个500ml的丝口瓶中，4瓶PBS均需做无菌实验。11、PBS使用时2个人共用一瓶，做好标记，避免交叉使用；保证有4瓶备用，当启用备用PBS时即需配制PBS，做上无菌实验。【操作步骤】1、浸泡滤膜：准备两个洁净的玻璃皿（要求直径大于10cm），分别做好标记，用1/2体积的超纯水分别浸泡孔径大小为0.22m 和0.45m的微孔滤膜各一张（要求滤膜完整无折痕且浸入水中均匀润湿），浸泡30min左右。2、高压蒸汽灭菌：准备4个洁净的500mL丝口瓶，用超纯水润洗一次，在瓶盖上贴上高压蒸汽灭菌指示胶带，将瓶盖旋紧，然后旋松半圈。准备洁净的不锈钢过滤器，把浸泡好的微孔滤膜按0.22m在下，0.45m在上的顺序组装不锈钢过滤器主体部分，将其出液口用纱布包裹，然后把不锈钢过滤器的所有组件用包布包裹，贴上高压蒸汽灭菌指示胶带。将、中准备好的待灭菌物品放入高压蒸汽灭菌器中，用固体模式进行灭菌。3、PBS配制：准备一个洁净的2L烧杯，用超纯水润洗3次，放入一个洁净的磁力搅拌器转子，然后盛入1900mL左右的超纯水。用电子天平按下表分别称取相应药品并倒入烧杯中，然后在磁力搅拌器上搅拌使其充分溶解。药品名称氯化钠氯化钾磷酸氢二钠磷酸二氢钾药品浓度8g/L0.2g/L2.9g/L0.2g/L称量质量16g0.4g5.8g0.4g用pH计测量溶液的pH值，并用NaOH和HCl将其pH调整至7.40。用超纯水将PBS在2L的量筒定容至2L，倒回2L烧杯，然后用保鲜膜封口。4、紫外灭菌：高压蒸汽灭菌结束后，在80以上的情况下，打开高压蒸汽灭菌器，迅速将丝口瓶的瓶盖旋紧，连同不锈钢过滤器一起转移到超净工作台中，再将双链球、一个洁净的500mL量筒和配制好的PBS放入超净工作台，在风机打开的情况下，打开紫外线照射30min左右。5、无菌过滤：在超净工作台中将不锈钢过滤器组装好，连接双链球和不锈钢过滤器，移去包裹出液口的纱布，向滤器中加入100mL左右的PBS，过滤到一个丝口瓶中，然后依次润洗4个丝口瓶。给4个丝口瓶做好标记，标清液体名称，制备日期，操作人员，并给4个丝口瓶编号1、2、3、4，按编号顺序依次将PBS过滤到相应的丝口瓶中，4保存备用。6、无菌实验：取4号丝口瓶的PBS 1mL和确认无菌的DMEM（10%FBS）1mL加入3.5cm皿，放入CO2培养箱培养，连续观察7天，若没有观察到任何微生物，视为本批次PBS均为无菌，可以用