生物固定新方法及原理.docx

固定化微生物原理及方法所谓固定化技术(IMC)，就是利用化学的或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性，可反复利用的方法。包括固定化酶技术和同定化细胞技术，微生物被固定后，细胞内酶系统保存完整，相当于一个多酶生物反应器，与传统的悬浮生物处理法相比，它具有处理效率高、稳定性强、反应易于控制、菌种高纯高效、生物浓度高、污泥量少、固液分离效果好、丧失活性可恢复等优。其固定方法国内外没有统一的分类标准，根据对各种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法两大类。物理同定法主要有吸附法、包埋法、截留法，化学固定法包括共价结合法和交联法1.1吸附法吸附法是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法。这是一种非常廉价、有效且常用的微生物固定化方法。吸附法可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、焦炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状态下离子健合作用而固定定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有DEAE一纤维素、CM一纤维素等。吸附法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小，但所固定的微生物数量受所用载体的种类及其表面积的限制。固定化对于吸附载体的要求包括：具有抗物理降解、抗化学降解、抗生物降解的稳定性，具有一定的机械强度和结构稳定性。根据载体性质可分为：有机载体和无机载体，有机载体又分为天然载体和合成载体。天然载体包括：聚多糖，如纤维素、葡萄糖；蛋白质，如明胶、胶原蛋白；碳材料，如无烟煤、木材等。合成载体包括：乙烯和马来酸酐的共聚物、戊二醛缩水甲基丙烯酯共聚物、合成的离子交换材料及塑料等。无机载体主要包括：玻璃、陶瓷、含水的金属氧化物及硅藻土等。Fig.1不同载体活性对比吸附载体聚氨酯泡沫木屑大孔树脂多空陶粒固定化细胞相对活性40.2%37.6%20.8%32.1%固定化细胞相对活性=（固定化细胞活性/游离细胞活性）*100%造成活性差异原因：各种载体的吸附容量不同，因而所固定的细胞量不同，有些吸附载体对微生物细胞可能有毒害作用，各种载体与微生物细胞之间的结合程度不一样，有些易脱落优点：吸附法操作简单，微生物固定过程对细胞活性的影响小，缺点：所固定的微生物数量受所用载体的种类及其表面积的限制，不够牢固易脱落。1.2包埋法包埋法是使微生物细胞包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及反应代谢产物可自由出入这些多孔或凝胶膜，而微生物却不能动。在溶液中改变一个或者多个参数，如，改变温度、盐度、PH值或者溶剂，一些天然或者合成高聚分子聚合物，通过沉淀作用形成凝胶。固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化;成本低;固定化过程中及固定化后对微生物无毒；基质通透性好；固定化细胞密度大；载体内细胞渗漏出少，外面的细胞难以进入；物理强度和化学稳定性好；抗微生物分解；沉降分离性好。包埋材料可分为：天然高分子多糖类和合成高分子化合物两大类。天然高分子：海藻酸钠、卡拉胶、角又菜胶、壳聚糖和琼脂，它们具有固化成型方便，对微生物毒性小及固定化密度高等有点。但它们抗微生物分解性能较差，机械强度较低。合成高分子化合物：常用的载体物质有聚丙烯酰胺、光硬化树脂、聚乙烯醇 PVA、聚丙烯胺 ACAM、聚乙烯乙二醇 PEG、聚碳酸乙烯酯（PVCA），甲基丙烯酸类等。它们的突出有点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学性能稳定。但聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞损害较大，而且形成多样性和控制性不好这种同定化方法操作简单，制作的同定化微球的强度高、能保持多酶系统、对微生物细胞活性影响较小；制备成本高，载体无法再生，传质阻力大，严重影响了微生物的生长和产物的代谢。1.3共价结合法共价结合法是细胞表面上功能团(如氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基等)和 固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落。但限制了微生物的活性，反应条件激烈，操作与控制复杂。有研究者使用此法固定卡尔酵母(Saccharomycesluteus)于已活化的多孔玻璃上，虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿酐酸的活性。1.4交联法交联法，是一种无载体固定法，通过物理或者化学手段，使酶和微生物细胞之间彼此附着固定。交联法可分为：1）化学交联，是通过微生物与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。为常见的交联剂是戊二醛、聚乙烯亚胺等。2）螯合法：主要是利用含水金属氧化物将其表面的羟基用酶或者细胞的适当配位体取代，形成部分共价键。最早，最多用于酶的固定。3）物理交联：利用微生物细胞自絮凝形成颗粒的一种方法。相对优点：对微生物细胞的生理和生态的影响小，有利于微生物功能的发挥；颗粒内部结构相对松散，传质阻力小；内部和表面可以不断更新，颗粒整体活性高；小颗粒的絮凝和大颗粒的解体在一定条件小可以达到动态平衡，不存在载体固定化细胞强度问题。这种固定方法的前提是，获得具有自絮凝能力的细胞系或者创造适宜于微生物细胞自絮凝的环境。随着技术的发展，我们可以根据需要来筛选或者改良细胞株来产生具有自絮凝能力的微生物。总的来说，交联法中微生物结合强度高，稳定性好，耐反应环境的变化能力强，但微生物的活性有较大的损失，同时交联剂比较昂贵，这些都限制了该方法的应用。1.5固定化技术研究中的热点和最新方法目前，在传统生物固定的基础上发展起来许多新的固定技术，主要有膜固定，无载体固定化，组合固定化技术，超微载体固定化，亲和配基固定化，絮凝吸附固定化，溶胶凝胶法：膜截留法；通过半透性膜、中空纤维膜、超滤膜等将微生物细胞截留，生物催化剂不能透过此膜，而产物和底物可以透过。联合固定技术：是将不同固定细胞、固定方法的组合。目的是为了克服单一固定化技术本身所固有的缺点。最初研究联合固定是将微生物细胞与酶结合在一起。主要分为两大类，1)生物催化剂联合：酶与酶，酶与微生物，酶、细胞与底物等物质联合，两种微生物细胞联合固定化等。2)固定化方法联合：吸附-交联，吸附-包埋，絮凝-膜截留联用等。Kaul等将底物与生物催化剂联合固定，用于在水溶液中溶解性的生物转化。Lin等研究将微生物细胞和酶与吸附剂联合包埋固定在水凝胶基质中，用于生物降解有毒有机污染物。Adercreutz等将蛋白小球藻与氧化葡萄糖杆菌联合固定于海藻酸钙凝胶中，藻类光和作用所产生的氧气直接供给菌体使用。溶胶凝胶法：就是用含高化学活性组分的化合物作前驱体，在液相下将这些原料均匀混合，并进行水解、缩合化学反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，溶胶经陈化胶粒间缓慢聚合，形成三维空间网络结构的凝胶，凝胶网络间充满了失去流动性的溶剂，形成凝胶。凝胶经过干燥、烧结固化制备出分子乃至纳米亚结构的材料。胶体（colloid）是一种分散相粒径很小的分散体系，分散相粒子的重力可以忽略，粒子之间的相互作用主要是短程作用力。溶胶（Sol）是具有液体特征的胶体体系，分散的粒子是固体或者大分子，分散的粒子大小在11000nm之间。凝胶（Gel）是具有固体特征的胶体体系，被分散的物质形成连续的网状骨架，骨架空隙中充有液体或气体，凝胶中分散相的含量很低，一般在13之间。溶胶-凝胶法的化学过程首先是将原料分散在溶剂中，然后经过水解反应生成活性单体，活性单体进行聚合，开始成为溶胶，进而生成具有一定空间结构的凝胶，经过干燥和热处理制备出纳米粒子和所需要材料。其最基本的反应是：(l）水解反应：M(OR)nH2OM(OH) x (OR) n-xxROH (2) 聚合反应：-M-OHHO-M-M-O-M-H2O-M-ORHO-M-M-O-M-ROH溶胶凝胶法与其它方法相比具有许多独特的优点：(1)由于溶胶凝胶法中所用的原料首先被分散到溶剂中而形成低粘度的溶液，因此，就可以在很短的时间内获得分子水平的均匀性，在形成凝胶时，反应物之间很可能是在分子水平上被均匀地混合。(2)由于经过溶液反应步骤，那么就很容易均匀定量地掺入一些微量元素，实现分子水平上的均匀掺杂(3)与固相反应相比，化学反应将容易进行，而且仅需要较低的合成温度，一般认为溶胶一凝胶体系中组分的扩散在纳米范围内，而固相反应时组分扩散是在微米范围内，因此反应容易进行，温度较低(4)选择合适的条件可以制备各种新型材料。溶胶-凝胶法也存在某些问题：首先是目前所使用的原料价格比较昂贵，有些原料为有机物，对健康有害；其次通常整个溶胶凝胶过程所需时间较长，常需要几天或儿几周：第三是凝胶中存在大量微孔，在干燥过程中又将会逸出许多气体及有机物，并产生收缩。溶胶-凝胶法也存在某些问题：通常整个溶胶凝胶过程所需时间较长（主要指陈化时间），常需要几天或儿几周；还有