磷酸苏氨酸裂合酶 α β-不饱和双键 加成 抑制剂 MAPKs.doc

磷酸苏氨酸裂合酶论文：磷酸苏氨酸裂合酶SpvC、OspF抑制剂的设计【中文摘要】MAPK信号通路广泛存在于动植物中,是细胞内重要的信号转导途径。病原菌能通过破坏MAPK信号通路来突破动植物个体的免疫防线,进攻组织和细胞,导致疾病的发生。效应蛋白SpvC、OspF是分别由沙门氏菌和志贺氏菌分泌的毒力蛋白,通过型分泌系统注入到宿主细胞,不可逆灭活宿主MAPKs,破坏宿主的先天免疫防线。有研究证实,以SpvC为代表的蛋白家族是一类新的酶,称作磷酸苏氨酸裂合酶,这类裂合酶能特异的识别磷酸化的MAPKs(p-MAPKs)的进化保守“pT-X-pY”序列,并不可逆的催化该模体中的磷酸苏氨酸(pT)发生消去反应,形成、-不饱和双键并释放一分子游离磷酸。当使用磷酸丝氨酸(pS)代替p-MAPKs中“pT-X-pY”模体的pT时,SpvC家族的磷酸苏氨酸裂合酶也能催化其发生上述反应。更进一步的研究发现,SpvC、OspF能与这种双键结构发生加成反应而失活。基于对SpvC家族的磷酸苏氨酸裂合酶催化机制的了解,本文设计了三种磷酸苏氨酸裂合酶的不可逆多肽抑制剂。通过对其抑制效果的分析、比较,发现抑制剂Erk5-S对SpvC、OspF活性的最大抑制程度分别为80%和40%,IC50值分别为200.【英文摘要】MAPK signaling pathway exist in both animal and plant generally,and is important pathway of signal transduction. Pathogenic bacteria can breakthrough the immunity line of defense by disturbing MAPK pathway to attack tissue and cell resulting in pathema, sometimes seriously. SpvC from nontyphoid Salmonella species and OspF from Shigella spp. are both virulence proteins,and injected into host cell by type III secretion system (TTSS) to inactivate their host MAPKs irreversibly and destroy the defense of innate.【关键词】磷酸苏氨酸裂合酶 -不饱和双键 加成 抑制剂 MAPKs【英文关键词】phosphothreonine lyase -unsaturated double bond Michael addition inhibitor MAPKs【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848【目录】磷酸苏氨酸裂合酶SpvC、OspF抑制剂的设计摘要4-5ABSTRACT5-6前言9-261、研究背景及意义9-102、MAPK 信号通路10-123、型分泌系统（Type III Secretion system）12-134、OspF 家族（包括SpvC）磷酸苏氨酸裂合酶的催化机制13-165、酶的抑制作用16-176、pET-SUMO 及pGEx-6 蛋白表达系统17-207、反相-HPLC 简介20-218、基因的定点诱变21-239、蛋白的纯化23-26第一章 目的基因的克隆、蛋白的表达及纯化26-481.1 引言与实验设计261.1.1 引言261.1.2 实验设计261.2 实验原理26-271.3 基因的克隆27-391.3.1 实验材料27-301.3.2 基因克隆所需仪器30-311.3.3 实验方法31-391.4 蛋白的大量表达及纯化（4层析柜）39-431.4.1 实验材料39-401.4.2 蛋白纯化所需仪器40-411.4.3 实验方法41-431.5 结果与讨论43-471.5.1 基因克隆的结果43-451.5.2 蛋白表达及纯化结果45-471.6 本章结论47-48第二章 抑制剂的制备与纯化48-552.1 引言482.2 实验材料48-492.3 实验所需仪器492.4 实验方法49-512.4.1 抑制剂的设计49-502.4.2 磷酸化多肽的-消去反应502.4.3 RP-HPLC(反相HPLC)50-512.4.4 碳碳双键的鉴定512.5 实验结果与分析51-542.6 本章结论54-55第三章 抑制剂对SpvC、OspF 活性的抑制55-703.1 引言553.2 实验材料55-563.3 实验所需仪器563.4 实验方法56-633.4.1 测活酶量的确定56-583.4.2 酶的自然失活情况58-593.4.3 抑制剂对酶活性的抑制59-623