临床微生物SOP-纸片扩散法药敏试验标准操作规程.doc

XXX医院检验科微生物实验室纸片扩散法药敏试验标准操作规程编号：MYCH/ 版本：第1版 第1次修改页数：第 5 页 共 5 页纸片扩散法药敏试验标准操作规程1目的对有意义的临床分离菌株进行标准化的抗生素敏感试验，对指导临床正确使用抗生素有非常重要的意义。纸片扩散法（K-B法）药敏试验是其中一种最常用也最易普及的方法，根据CLSI的执行标准，按不同的细菌选择不同组合的抗菌药物进行药敏试验，并根据结果结合菌株来源及CLSI的相关注释给临床医师提供针对各类患者选择最佳抗菌药物的参考依据，从而防止不规范用药及多重耐药菌株的产生或传播。根据本实验室的分离菌株范畴，制定及规范相应的纸片扩散法药敏试验操作程序。2原理将含有定量抗菌药物纸片贴在已定量接种检测菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对检测菌的最低抑菌浓度( MIC)呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。3试验范围应用于快速生长的病原菌如葡萄球菌属、肠球菌属、肠杆菌科菌等；同时也应用于某些苛养菌，如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌属菌等。4设备、材料和试剂4.1 设备II级生物安全柜、恒温培养箱、C02培养箱、纸片加样器、游标卡尺、TEK 2光电比浊仪。4.2抗菌药物纸片的要求与贮存选择直径为6mm、吸水量为20ul的专用商品化药敏纸片（生产商为安图）；药物纸片与干燥剂一起置-30冰箱保存备用；常规使用纸片则是从-30冰箱取出1周用量，放4冰箱保存；每次使用前先室温平衡30min后再开启容器，以免冷凝水浸湿纸片而使其效价下降。4.3培养基自配的药敏培养基用塑料盒密封后可在28冰箱内保存1周，商品培养基按其保存条件仅供在有效期内使用。使用前先将平板置35恒温箱温育30min，使其表面干燥。4.3.1生长较快的需氧和兼性厌氧菌的药敏试验培养基：选用水解酪蛋白琼脂（MHA）平板。4.3.2链球菌属药敏试验培养基：选用5%脱纤维羊血MHA平板。4.3.3嗜血杆菌属细菌药敏试验培养基：选用嗜血杆菌药敏平板(HTM)。4.3.4淋病奈瑟菌药敏试验培养基：选用淋球菌药敏平板（GC琼脂平板）。4.4接种菌量比浊标准菌液浓度为1.5l08/ml，相当于0.5麦氏单位标准（用比浊仪进行调校）。5. 操作步骤5.1制备接种菌液直接菌落悬液法，在检测菌平板上挑取培养1824h的纯菌落均匀溶解于2ml无菌生理盐水中，用比浊仪调校浓度至0.5麦氏标准；链球菌属、淋病奈瑟菌和嗜血杆菌属细菌用营养肉汤调校0.5麦氏标准菌液；校正后的菌液应在15min内接种。5.2接种用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后在琼脂表面均匀涂布接种，每旋转平板600涂布接种1次，如此反复3次，最后沿平板边缘涂抹2周。5.3贴纸片接种好的药敏平板在室温下放置3 5min，用无菌镊子将药敏纸片按要求紧贴于琼脂表面。5.4孵育接种好的平板放置35孵育（苛氧菌的药敏试验需放35、5%C02环境），在孵育箱内不要超3个平板叠在一起，否则中间的平板达不到规定温度而产生预扩散的作用，平板一般孵育l 624h方可读取结果。5.5判读结果培养后的平板，用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌环直径，以没有肉眼明显可见生长物区域为抑菌环边缘，按抑菌环直径来判断抗生素的敏感性，应依据CLSI所提供的各种细菌的抑菌环直径解释标准来进行结果判读。注意以下判读技巧。5.5.1肉眼观察时平板应保持在反射光照明的非反射黑的背景上方处进行，在抑菌环边缘需借助放大镜才能观察到的微小菌落生长可忽略不计。5.5.2有的菌株如变形杆菌可出现蔓延生长，在抑菌环内出现淡淡云雾样生长，还有甲氧苄啶和磺胺类药物在抑菌环内允许出现轻微生长（20%或较少菌苔），可忽略不计。5.5.3对不典型不常见的结果必须重复试验进行确定（如A群链球菌对青霉素G应是敏感的，如果耐药则为不典型结果）。5.5.4在抑菌环内生长较大菌落，可能是混合菌或同一菌株中的耐药菌。通过革兰染色如证实为原被检目的菌，则不论其抑菌环有多大均应报告为耐药，如为混合茵，应重新纯分鉴定后再做；被检菌如为沙雷菌，在含多粘菌素B纸片周围出现细菌生长环，而在此之外又出现抑菌环，即所谓双环现象( cocarde)，应视为耐药。6.各种常见细菌药敏试验。参见最新CLSI标准。参考文献1 CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；Nineteenth Informational Supplement.CLSI document M100 S20.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute, 20092 叶应妩，王毓三，申子瑜主编全国临床检验操作规程第三版南京：东南大学出版社，20063 李影