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外周血检测指导下的个体化治疗2013年07月26日08:19来源：中国医学论坛报窗体顶端 窗体底端目前在实践中，反复进行组织活检无论在伦理还是实际操作上均有一定难度。故利用外周血建立分子检测体系有重要的意义。目前大家不仅致力于外周血单一基因检测，更探寻利用外周血进行全基因组或外显子组分析以指导个体化治疗的可行性。在本文中，北京大学肿瘤医院的王洁教授总结了今年美国临床肿瘤学会（ASCO）会议及近期文献上相关研究报道，以飨读者。外周血基因检测指导下的个体化治疗 意义何在？靶向药物的问世为逆转肿瘤进程提供了可能。尤其是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗为EGFR突变型晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来疗效、无进展生存（PFS）时间及生活质量的显著改善，已成为肺癌靶向治疗的经典。但在实践中，几乎所有EGFR突变者均难逃因获得性耐药而治疗失败的命运，耐药是限制靶向治疗成为肺癌治愈性手段的瓶颈。现有证据表明多数肿瘤内存在各种亚克隆即遗传异质性。所谓的临床获得性耐药并非是在治疗过程中细胞水平的耐药产生，而是预先存在的肿瘤内克隆异质性对治疗选择性压力的反应。近期国内外系列研究表明，应用初治前的组织标本行分子检测试图指导整个治疗过程的策略对部分患者并不合适，重复活检进行实时基因分析才能更精准地反映治疗过程中细胞内各亚克隆的动态变化。然而在实践中，反复进行组织活检无论在伦理还是实际操作上均存在一定难度。因此，利用外周血（游离DNA、循环肿瘤细胞等）建立实时、动态、无创、定量的分子检测体系有重要的意义。目前国际上有多个课题组不仅致力于外周血单一基因的检测，更探寻利用外周血游离DNA或循环肿瘤细胞行全基因组/外显子组分析以指导个体化治疗的可行性。外周血游离DNA EGFR-TKI基因突变的定性、定量检测肿瘤患者外周血中存在因瘤细胞凋亡、坏死而释放的游离DNA，是非肿瘤患者的10倍。其遗传学特征与肿瘤细胞相同。国内外多项回顾性研究显示，若以组织标本检测为金标准，晚期患者外周血EGFR突变检测的特异性为90%100%，敏感性为60%82%，二者的一致性为60%80%，且与TKI的疗效和PFS相关。在今年ASCO会上报告的前瞻性随机多中心临床研究FASTACT 2的回顾性血浆DNA EGFR突变分析结果表明，以外周血为基础的基因检测指导个体化治疗指日可待。在427例可用于分析的血浆标本中，32%为EGFR突变阳性。其中224例有配对组织标本，血浆检测的敏感性为77%，特异性为96%，EGFR活化突变阳性、阴性预测价值分别为93%和86%。两种标本的一致性为88% 。此数据与笔者既往研究非常接近。尤其重要的是，该研究显示血浆DNA EGFR突变对生存时间的预测与组织突变者高度一致。突变患者接受厄洛替尼与化疗联合治疗的无病生存时间和中位生存时间长于单纯化疗组。而野生型患者无显著差异。这些结果表明，外周血EGFR突变的假阳性率低，临床上一旦检测结果阳性，可指导EGFR-TKI的选择；检测结果阴性，则可能为假阴性。未来研究将致力于提高外周血EGFR突变检测的敏感性和对治疗预测的准确性。同时，基于目前的研究均为回顾性多中心或单中心研究，开展前瞻性多中心研究迫在眉睫。只有如此，才能改写我们的治疗指南。除EGFR敏感性突变外，外周血耐药基因，如T790M、KRAS突变的检测研究亦风生水起。虽然相较于EGFR突变，外周血耐药基因检测的研究尚需更多探索，但敏感及耐药多基因平行检测体系更能反映治疗过程中异质性肺癌各克隆间的动态改变规律。同时，肿瘤异质性及治疗压力选择下的动态改变特点亦表明，在个体化治疗的时代，单纯定性检测T790M等单一基因突变远远不够，实现定量、动态、尤其无创的耐药基因检测才能指导更为精准的个体化治疗。血浆游离DNA基因组分析的研究进展肿瘤是基因组疾病，故单一基因检测难以满足指导个体化治疗的需要。近期多项研究利用二代测序技术分析了血浆游离DNA基因组、外显子组改变与治疗疗效的关系。例如近期发表于自然（Nature）的英国剑桥大学癌症中心研究，分析了治疗过程中6例乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者外周血游离DNA外显子组、尤其相关基因深度测序变化与耐药的关系。对每位患者在治疗过程中行25次血标本分析，结果定量分析血浆中等位基因片段有助于发现耐药相关基因。例如紫杉醇治疗过程中PI3KCA突变率增高，铂类治疗中的RB1突变，他莫昔芬、曲妥珠单抗治疗中MED1的突变增加，随后拉帕替尼治疗后出现的剪切变异GAS6，肺癌患者TKI耐药中出现的T790M突变。这些结果表明，外周血游离DNA外显子组分析作为侵袭性活检组织的替代，能发现耐药相关基因改变，监测治疗过程。另一组发表于新英格兰医学杂志（N Engl J Med）的研究对30例晚期乳腺癌治疗过程中动态获取的外周血游离DNA进行全基因组测序，发现游离DNA全基因组测序是更敏感的可预测疗效的分子事件。而在ASCO会议上报告的一组大样本研究则探讨了利用外周血游离DNA染色体不稳定与拷贝数变异（CNV）作为乳腺癌标志物的可行性。循环肿瘤细胞深度测序分析的研究进展循环肿瘤细胞（CTC）是有关外周血分子标志物研究的另一焦点。其作为完整的、无损伤的肿瘤细胞，能反映肿瘤的转移、耐药、进展等过程。既往的研究更多聚焦于乳腺癌、前列腺癌、肠癌治疗前后CTC的数量或单一基因如HER2等的变化与疗效、预后的关系。而肺癌CTC的研究滞后于上述几种肿瘤，主要涉及数量变化的预测意义。近期美国哈佛大学有学者分析了CTC的上皮间质转化（EMT）与乳腺癌化疗或靶向治疗的关系，发现CTC中EMT比例升高者对治疗的反应劣于上皮标志物表达高的患者。而对于大部分肿瘤，微量的CTC是进行基因组分析的最大挑战。近期笔者课题组与哈佛大学和北京大学生命研究科学院的谢晓亮教授合作，进行了晚期肺癌CTC单细胞基因组和外显子组分析，试图探寻肿瘤靶向治疗耐药、转移、甚至表型转化的机制。初步结果显示，CTC中外显子组突变的异质性虽然明显，但与肿瘤耐药或表型转化相关的基因在CTC中富集。尤其是同一患者不同CTC间的拷贝数变异（CNV）有高度可重复性，不同患者CTC在某些特定染色体区域亦存在高度可重复性的CNV，因此认为CNV可能是转移的重要和必备的分子基础。进一步的研究仍在继续中。小结综上，外周血EGFR突变检测指导下的EGFR-TKI治疗成为临床常规已仅有一步之遥。我们需要前瞻性数据证实并提高检测的敏感度。外周血游离DNA或CTC的全基因组