SDS电泳论文.doc

得分：_南 京 林 业 大 学研究生课程论文20072008学年 第二学期课程名称：天然生物活性物质分离与纯化论文题目：SDS-聚丙酰胺凝胶电泳技术学科专业：森林培育学 号：3070517作 者：李莹莹任课教师：吴彩娥 教授二00八年六月11目录0 引言11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发展22、SDS-聚丙烯酰胺凝胶原理22.1样品的浓缩效应32.1.1凝胶层的不连续性32.1.2缓冲液离子成分和电位梯度的不连续性32.1.3 pH的不连续性42.2 分子筛效应42.3 电荷效应53SDS-PAGE凝胶体系53.1聚丙烯酞胺凝胶的特点53.2凝胶浓度的选择64 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要操作64.1 制板64.2 制备分离胶74.3 制备浓缩胶74.4 电泳74.5 染色和脱色75 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用75.1测定分子质量85.2对猪皮水解胶原蛋白的分离85.3 提纯蛋白质85.4 检测牛奶中掺杂的豆奶95.5 发芽糙米中谷蛋白亚基电泳分析96 结束语9参考文献：10SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术摘要：生物样品分子量的测定方法有多种，近年来，SDS-聚丙酰胺凝胶电泳技术用于生物样品的分离、纯化和鉴定评价较高，其主要作用是分辨率高，设备简化，方法易行。自SDS-聚丙酰胺凝胶电泳技术建立以来，已经被逐渐地应用于各个领域。本文主要介绍了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发展、原理，并对SDS-聚丙烯酰胺凝胶体系中凝胶的性质及其主要操作方法进行了概述,最后讨论了SDS-聚丙酰胺凝胶电泳技术在食品工业中的应用。关键词：电泳；十二烷基硫酸钠；聚丙烯酰胺凝胶；应用0 引言 电泳是一种分离蛋白质和其他物质如核酸、嘌呤、嘧啶、一些有机化合物甚至无机离子的主要方法或技术。目前的电泳大多是在固定化的介质中将样品放入流动相中进行分离,而不采用完全自由态的溶液进行分离。固体支持物的种类很多,如纸、乙酸纤维素、硅胶、氧化铝、琼脂糖、淀粉及聚丙烯酰胺凝胶等1。特别是聚丙酰胺凝胶电泳,由于它是一种多孔胶,其凝胶孔径与蛋白质分子大小接近,提高了对蛋白质的分辨能力。而且聚丙烯酰胺凝胶质胶方便,代价低,机械强度、化学稳定性好,重复性强,对pH和温度变化稳定,非特异吸附和电渗多很小,凝胶透明,易于显色并观察。除此之外,聚丙烯酰胺凝胶电泳与下一步的蛋白质提纯和蛋白质鉴定方法如免疫印迹、质谱鉴定等兼容性较好,因而使得聚丙烯酰胺凝胶成为首选的蛋白质分离介质。聚丙酰胺凝胶电泳有三种类型,等电聚焦-聚丙酰胺凝胶电泳( isoelectric focusing polyacry amide gel electrophoresis, IEF - PAGE) 、十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sufate - polyacryamide gel electrophoresis, SDS -PAGE)及孔梯度- 聚丙酰胺凝胶电泳(pore gradient - polyacryamide gel electrophoresis, PG -PAGE) 。IEF凝胶是按蛋白质等电点不同来分离蛋白质的,对凝胶按相对分子质量大小的筛分能力要求不高,用低浓度胶即可; SDS - PAGE分离蛋白时,不仅要根据蛋白质的带电密度分离,而且还要根据被分离样品的相对分子质量大小设计相应的浓度的胶; PG - PAGE是按照凝胶孔径从上至下不断减小的体系中,在电场力的推动下而移动的不同大小的蛋白质分子会在不同位置明显受阻而形成极窄的区带,从而提高分辨率。自从十二烷基硫酸钠一聚丙酰胺凝胶电泳技术(Sodium Dodecatyl Sulfate Polyacry lamide Gel Electrophoresis, SDS - PAGE)作为一种高效的分辨蛋白质的方法建立以来，已经被逐渐地应用于各个领域。在近几年中，SDS-聚丙烯酰胺凝胶技术在食品科学领域的运用更加广泛。1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的发展Shapizo在1967年首先建立了SDS电泳技术。Webe:和Obsorn在1969年发现，在凝胶系统和样品液中加人十二烷基硫酸钠(SDS)以后，对经过处理的蛋白质组分能够进行更好地分离。Laemmli在1970年首次使用了三经甲基氨基甲烷(Tris)一甘氨酸缓冲系统，并对SDS - PAGE方法进行了改进，这一缓冲系统以后被普遍采用2。Bothe等在1985年对这一技术进行了再改进，采用Amediol缓冲系统(a-Amino-2-mythyl-1, 3-propanedione)对高分子和低分子有选择性地进行分离。Fling和Gregerso在Laemmli方法的基础上进一步改进，增添了对电泳后的凝胶固定这一步骤，可固定一些低分子量的蛋白质，如小链肽、血管紧张素、杆菌肽等，并将样品中的蛋白质的电泳结果与标准蛋白的电泳结果相比较，可对被分离的蛋白质依据分子量大小进行定性分析，并可通过谱带的强度，借助于光密度仪进行定量分析。现在，SDS一PAGE这一技术己趋于完善。2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶原理SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18nm），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小3。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是在聚丙烯酰胺凝胶电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即：凝胶层的不连续体系、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中有三种物理效应：样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应、电荷效应。2.1样品的浓缩效应浓缩效应即由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。2.1.1凝胶层的不连续性两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离4。2.1.2缓冲液离子成分和电位梯度的不连续性在浓缩胶中选择pH6.7，电泳槽缓冲液pH8.3，HCL几乎全部释放出CL，甘氨酸（等电点在6.0；羧基解离pKa12.34，氨基NH3解离 pKa29.7 ）在此条件下有极少部分的分子（0.11）解离成为甘氨酸负离子CH2(NH2)COO；在pH6.7下，大部分蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近pH5.0）这三种粒子都带有相同电荷，当电泳系统通过一定电流后，三种离子同时向正极移动，而且他们的有效泳动率按以下次序排列。Cl-蛋白质CH2(NH2)COO 根据有效泳动率的大小，最快的成为快离子，最慢的称为慢粒子。电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳液含慢离子。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会很快超过蛋白质。因此，在快离子的后面就会形成一个离子浓度低的区域，即：低电导区。电导与电压梯度是成反比的：E(电压梯度)I（电流强度）（电导率）所以低电导区就有了较高的电压梯度，这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速运动。当电压梯度与和泳动率乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同（即V=mE）移动速度(泳动率电场强度)。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在两种离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。由于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层5。2.1.3 pH的不连续性在分离胶与浓缩胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度从而控制其有效迁移率。要求在浓缩胶中，慢离子较所有分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中，慢离子的有效迁移率较所有样品蛋白质的有效迁移率高。使样品不再受离子界面的影响6。2.2 分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同。因此，表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使静电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子的走在前面，大分子的走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出7。2.3 电荷效应蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的泳动得快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的条带。在进入分离胶时，此电荷效应仍起作用8。3SDS-PAGE凝胶体系根据同一体系中凝胶浓度是否相同, SDSPAGE可分为连续系统和不连续系统。不连续系统由浓度较低的浓缩胶和浓度较高的分离胶组成,浓缩胶能使蛋白质从最初的样品溶液中浓缩出来,形成狭窄的蛋白质浓度较高的区带,这样所有的蛋白质分子都从同一点开始电泳,从而提高了分离效果，其中SDS-PAGE体系中的分离胶和浓缩胶都为聚丙烯酰胺凝胶。3.1聚丙烯酞胺凝胶的特点聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶有下列特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率9。3.2凝胶浓度的选择按照待分离的蛋白质的分子质量不同,可选择不同浓度的分离胶。凝胶浓度与被分离蛋白质分子量大小关系如表1.表1 凝胶浓度与分子量范围的关系样品分子量范围分离胶浓度（%）蛋白质10420-30（1-4）10415-204（104-105）10-15（1-5）1055-1051052-5核酸10415-20104-1055-10105-21052-2.6凝胶浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。一般凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。交联度C的影响较小，一般取3-5%10。4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要操作4.1 制板SDS-聚丙酰胺凝胶配制成后，可以注入玻璃管中铸成柱状，进行圆盘电泳。也可以将凝胶液注入由两块玻璃板构成的间隙中铸成板状，进行垂直板状电泳。两种方法均可得到满意的结果。4.2 制备分离胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。胶液配好，用玻璃棒迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺lcm高的水。铺好后将胶板放置于室温约20-30min左右使之凝聚。此时，在凝胶和水之间可以看到清晰的一条界面。然后吸出胶面上的水。4.3 制备浓缩胶浓缩胶一般用3%-5%，其用量根据实际情况而定。胶液制备好后注入分离胶上部，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐，而后插入“梳子”，在室温放置2030min，浓缩胶即可凝聚。凝聚后，慢慢取出“梳子”。取出“梳子”后，在形成的胶孔中加入蒸馏水，冲洗未凝聚的丙烯酰胺等，倒出孔中水。4.4 电泳加样后，接通电源，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶时，将电流调至2030mA继续电泳，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部上方约1cm时，关闭电源。拔掉固定板，取下玻璃板，取出胶板。4.5 染色和脱色经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色12小时或过夜。染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰1112。5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 食物中的蛋白质组成情况可以从电泳图谱中表现出来。SDS-PAGE技术已逐渐应用于食物原料种类的鉴定、食品的蛋白质组成的分析、食品在贮藏和加工过程中的质量变化等方面的研究，近几年，利用这一技术对食物中蛋白质种类差异、性质以及在贮藏加工过程中蛋白质的变化等研究有了新的进展。5.1测定分子质量Lambin等人(1976)报告了一种测定蛋白质分子质量的新法方，即十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺梯度凝胶电泳法(简称SDS-PAGG电泳法)，并确证蛋白质在SDS中保温后，其分子质量对数和聚丙烯酞胺浓度对数之间，存在直线关系，这种关系用于测定分子质量介于12000-200000的蛋白质，具有良好的准确性。以后，Lambin用上述方法对分子质量介于13000-950000的蛋白质和7种多肽链进行SDS-PAGG电泳，进一步证实了上述线性关系13。此法至问世至今，经过不断的完善，现已广泛的应用在物质的分子质量测定方面，其中汪建雄等（2005）以SDS-PAGE电泳为基础, 经改进后, 选定2.6%的分离胶交联度, 在10%25%浓度范围调制各档分离胶进行试验,测定小分子多肽的分子量14。5.2对猪皮水解胶原蛋白的分离胶原由于其独特的结构、化学及生物学性质，被人们广泛用于食品、化妆品、医药等工业领域。因此，人们对胶原和胶原蛋白的水解产物进行了广泛深人的研究。其中胶原蛋白的水解产物的分离、分析，对进一步揭示水解作用机理、控制水解产物分子质量及对水解产物中不同分子质量大小的各个组分的分离纯化具有重要意义。戴红15等人利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对猪皮水解胶原蛋白进行分离，在选择恰当的缓冲溶液体系、凝胶体系的基础上，对凝胶浓度、样品的浓度、进样量和染色的方法进行了大量的实验。结果表明，采用SDS-聚丙烯酞胺电泳对胶原蛋白水解产物进行分离分析，在浓缩胶浓度3%、分离胶浓度10%的条件下，可达到较好的分离效果。5.3 提纯蛋白质对于含有多种成分且各蛋白质成分的分子质量相差较小的菌体蛋白质的提纯，用一般的沉淀法、层析法均达不到理想效果。盖新娜16等人选用SDS-PAGE的方法进行提纯，并尝试电泳后不经过染色，直接从凝胶中分离所需要的蛋白质成分，取得了较好的提纯效果。5.4 检测牛奶中掺杂的豆奶SDS-PAGE是检测半定量牛奶、豆奶混合物中的豆奶和牛奶蛋白的非常有效的方法。蛋白分离不需要制备缓冲液，考马斯兰染色可快速得到灵敏度高和背景染色弱的结果17。5.5 发芽糙米中谷蛋白亚基电泳分析郭晓娜18等人通过SDS-PAGE对发芽糙米、糙米和白米的谷蛋白亚基进行比较分析，采用Scnim-age软件对电泳图谱进行处理。结果表明，发芽糙米、糙米和白米谷蛋白中含量较高的各亚基分子量没有太大差别，只是含量不同:含量较低的亚基在分子量和含量上均存在一定的差别。6 结束语 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法, 自Shapizo1967年建立了以来，以其具有的操作简便,快速,所需设备廉价的优点而得到广泛的应用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在工农业生产中应用广泛，适用于食品，药品检测，天然产物分析及特定物质的分离制备等。随着科技的不断发展，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将会与其他分析技术紧密结合，创造出更新更好地分析分离方法，以适应社会需求。参考文献：1 高艳利 , 杨思文, 樊凯奇.SDS - PAGE电泳技术分析蛋白质的研究J. 辽宁化工，2007，36（7）：460-464.2 郭尧君. SDS电泳技术的实验技术考虑及最新进展J. 生物化学与生物物理进展, 2001，18 (1) : 32 - 37. 3盖颖,王文棋,蒋湘宁. 一种改进的双色SDS -PAGE凝胶和可视化上样电泳方法J. 北京大学学报, 2006，28 (1) : 103 - 106.4朱运峰,冯东晓, 李春海.聚丙烯酰胺凝胶电泳在分离小分子物质中的应用J. 生物技术通讯, 2002，19(3) :303 - 305.5汪建雄, 隋秀芝, 陈育晖,等.用SDS-PAGE 电泳法测定小分子多肽分子量的研究J. 生物化学与生物物理进展, 2005 , 18 (1) : 3237.6张宏丽