toll样受体.doc

大菱鲆干扰素调节因子-3（IRF-3）的全长cDNA克隆及序列分析大菱鲆干扰素调节因子-3（IRF-3）的全长cDNA克隆和序列分析目 录第一章 前言1.鱼类干扰素的研究进展12.1鱼类干扰素的发现及其作用12.2鱼类干扰素分子的结构 22.3鱼类干扰素系统的作用机制32.鱼类干扰素调节因子家族的研究进展53.1鱼类IRF的分类及分子结构63.2鱼类IRF的作用63.3鱼类IRF-3的分子结构83.4 鱼类IRF-3在免疫反应中的作用机制93.本项研究的目的与意义10第二章 大菱鲆的IRF-3的全长cDNA克隆及序列分析1.实验材料121.1实验动物、菌种及质粒121.2仪器设备121.3溶液试剂132.实验方法142.1大菱鲆头肾组织获取142.2总RNA的提取及质量检测142.3 cDNA第一链的合成142.4核心片段的克隆及测序142.4.1核心片段的PCR反应152.4.2 PCR产物的回收152.4.3 PCR产物与载体连接152.4.4感受态细胞的制备与连接产物的转化152.4.5阳性克隆的鉴定162.4.6 核心片段的序列分析162.5 3RACE和5RACE片段的克隆及测序162.5.1 3RACE和5RACE克隆特异性引物设计162.5.2 3RACE片段的克隆及测序172.5.3 5RACE片段的克隆及测序 172.6序列分析与进化树的构建173.结果分析183.1 RNA样品的制备与质量检测183.2核心片段克隆及测序结果183.3 3RACE片段的克隆及测序结果203.4 5RACE片段的克隆及测序结果223.5 全长序列的拼接243.6 IRF-3的cDNA的序列分析243.6.1 IRF-3的cDNA的序列和推断的氨基酸序列243.6.2 IRF-3的氨基酸序列的同源性比较263.6.3 IRF-3系统进化分析284.讨论29总结30参考文献31致谢33第一章 前言1文献综述大菱鲆(Scophthalmus maximus)，在中国又称“多宝鱼”。原产欧洲北海、波罗的海和地中海沿岸，属硬骨鱼纲、鲽形目、鲽亚目、鲆科、菱鲆属。大菱鲆生长迅速、肉味鲜美，是名贵的食用鱼。九十年代中期引进中国山东、福建等水温较低的地区养殖，在我国北方沿海养殖得到了迅速发展，产生了巨大的经济效益。随着大菱鲆养殖规模的迅速扩大，由病毒性疾病所引起的经济损失也日益突出。虽然现在可以通过提高养殖水质或药物防治病害，但是这些只是治标不治本的方法。现代生物技术研究由形态水平逐渐深入到细胞、生化，基因水平，因此可以从基因水平在根源上降低病毒害造成的损失，提高和改善鱼类的免疫功能。在20世纪后20年，哺乳类IFN系统的分子研究取得了重大进展，随之对低等脊椎动物的IFN系统基因及其分子机制也展开了研究。作为变温动物的鱼类，其非特异性免疫应答受温度的影响较大，而干扰素作为先天性免疫系统的一种关键因子，在鱼类抵抗病毒感染中发挥了非常重要的作用1。因此对IFN系统的研究及其作用机制的深入了解，利用生物技术培养抗病能力强、生殖周期短、产量高的新品种，对于鱼类病毒性疾病的防治研究具有重要的理论和实际意义，对养殖业的发展、经济的快速发展有重要意义。并且，对相关科学领域的研究也提供了重要的理论依据。2鱼类干扰素系统的研究进展2.1鱼类干扰素的发现及作用干扰素（Interferons，IFN）是机体细胞在病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等的作用下由受体细胞分泌的一种具有高度生物活性的糖蛋白2，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能。早在1957年由Isaacs和Lindenman发现了干扰素3，他们观察到受病毒感染的细胞培养基中能产生一种蛋白，这种蛋白与细胞结台后，就能在细胞间产生复杂连串的结果，致使细胞具有抵抗其它病毒感染的能力4。另外，干扰素系统除了抗病毒作用外，它还参与其他重要的生理过程，如调节细胞的生长、分化、凋亡以及机体免疫反应等。干扰素具有广谱抗病毒活性，不仅可以抑制多种RNA病毒，又可抑制多种DNA病毒。但不同病毒对IFN的敏感性也不同，其中对有囊膜的病毒最敏感。干扰素几乎作用于病毒复制的每一阶段，通过减少病毒繁殖量以及减轻细胞损伤的方式发挥作用。I类干扰素抗病毒作用主要通过旁分泌作用，病毒感染的细胞分泌的干扰素能保护邻近的细胞不受感染，从而起到抗病毒作用。而II类干扰素则主要起到抑制病毒增殖的作用，其抗病毒活性比I类干扰素要差，由于IFN-是一种淋巴因子，是由病毒抗原刺激淋巴细胞产生，在机体发挥免疫作用后才产生，其发挥的抗病毒作用较I类干扰素更迟。干扰素近几年陆续在虹鳟(Salmo gairdneri)、鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫鱼(Carassius auratus)、大马哈鱼(Oncorhynchus keta)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、舌齿鲈(Dicentrachus labrax)、斑马鱼(Brachydanio rerio)、大西洋鲑(Salmo salar)等鱼体或培养细胞系检测到干扰素活性物质5-8。2.2鱼类干扰素分子的结构在哺乳类中，主要有三类干扰素，它们分别是：INF，INF，INF。其中，INF和INF被称为类干扰素；INF被称为类干扰素。两者有不同的细胞起源，结构不同、结合受体不同，介导的生物活性也不同。但后来研究者又发现了新一族的干扰素，称为干扰素，和I型干扰素具有类似活性，功能上与I类IFN接近，但是它的结构、受体和来源不同。自1965年首次发现鱼类细胞能够分泌类似哺乳类干扰素的抗病毒活性物质后9，又陆续发现多种鱼类都能够产生干扰素。目前，在鱼类中发现2类干扰素：I型IFN，耐酸、耐热，类似于哺乳动物IFN- /，可以由病毒和双链RNA（dsRNA）诱导产生；II 型IFN，即IFN- ，不耐酸、不耐热，可被有丝分裂原等诱导，由白细胞、T细胞或巨噬细胞产生10。鱼类IFN的pI为5.47.1；分子量介于1694kDa；对胰蛋白酶敏感；具有抗RNase、DNase；具糖蛋白性质11。研究发现，鱼类I型IFN在基因结构上与高等脊椎动物的I类干扰素基因不同，存在5个外显子和4个内含子。鱼类I型干扰素的前体蛋白具有143153个氨基酸，N端2123个残基为信号肽序列，其信号肽序列在不同鱼种间部分同源，但与高等脊椎动物干扰素信号肽序列存在较大差异12。鱼类IFN基因包含4个外显子和3个内含子，编码一个148157个氨基酸的前体蛋白含有2324个氨基酸的信号肽13。鱼类IFN的信号肽序列与高等脊椎动物的一致性较低，且不同鱼种间IFN序列的一致性也很低。2.3鱼类干扰素系统的作用机制干扰素并不能直接杀灭病毒，在哺乳动物中干扰素信号的传递主要是依赖于JAK（Janus kinase）-STAT（signal transducers and activators of transcription）途径。目前，已发现JAK激酶包括Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2；已发现的STAT蛋白包括：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b以及STAT6。宿主细胞对病毒核酸和dsRNA的识别是通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）进行的，细胞应答TLR3、TLR4、TLR7或TLR9的活化信号而产生干扰素。其中TLR3识别病毒的dsRNA和PolyI：C(人工合成的dsRNA)；TLR7和TLR8识别单链RNA（ssRNA）；TLR9则识别病毒的非甲基化CpG的DNA基序。活化的TLRs激活IRFs，后者激活I型干扰素的转录14。在鱼类中已鉴定的TLRs分子有：日本河豚TLR2、日本牙鲆TLR2-1和TLR2-2、斑马鱼TLR3、沟鲶TLR3和虹鳟TLR3。虹鳟TLR3与人TLR3具有很高的同源性，经病毒和PolyI：C诱导后表达于虹鳟肾和脾组织中24。2008年，Skjveland等克隆了大西洋鲑的TLR9基因，证明了IFN-是TRL9的重要诱导剂。这些研究的结果将为进一步阐明鱼类免疫系统奠定了基础。目前对高等脊椎动物的干扰素的免疫调节作用已经有了比较完整的认识，而对鱼类的干扰素研究却处于初始阶段。研究已发现JAK-STAT信号途径也存在于鱼类的干扰素免疫反应中。JAK激酶能够激活STAT蛋白，STAT蛋白最初存在于细胞质中，磷酸化后被转运至细胞核发挥转录调节因子作用。Leu等首先克隆出河豚Jak1基因，随后Jak2、Jak3和Tyk2基因从河豚基因组中鉴定出来。斑马鱼STAT1和STAT3基因是最早被鉴定的鱼类STAT基因，其中斑马鱼STAT1具有拯救人STAT1基因缺陷细胞株的IFN信号传导的功能。从病毒感染的鲫鱼囊胚细胞系（CAB）中，鉴定出CaSTAT1和CaJAK1基因，CaSTAT1基因的表达受草鱼出血病毒（GCHV）、PolyI：C和IFN的诱导16。随后发现STAT2与DNA的结合能调节多种干扰素刺激基因（IFN-stimulated gene，ISG）的表达，在这个过程中鉴定出两种新的ISGs：Jun-D（JUND）和claudin-4（CLDN4），它们在I型IFN抗病毒反应中起关键作用17。干扰素通过与其受体结合而发生生物学作用。在哺乳动物中，I型干扰素受体是IFNAR，由IFNAR 1和IFNAR 2两个亚基组成，I型干扰素的抗病毒作用主要通过2步信号传导途径来完成（图1-1）。首先，病毒感染的细胞识别dsRNA，通过TLR3激活转录因子IRF-3和NF-B后转移到核中，结合到IFN-启动子上。磷酸化的IRF-3首先与CBP/p300结合成复合体，后者能够激活IFN-基因的转录。其后，IFN-被分泌到胞外，并结合到干扰素刺激的细胞的IFN-/受体上。该配体-受体复合物激活Tyk2和Jak1激酶，使转录因子STAT1和STAT2磷酸化。活化的STATs脱离细胞膜受体进入细胞核中，二聚化并且结合IRF-9，激活ISG基因启动子上的干扰素刺激反应元件（Interferon stimulated response element，ISRE）。最后，ISG基因的转录被诱导，导致干扰素刺激的细胞合成抗病毒蛋白14。最近发现I型IFN还能激活另外两种信号传导途径：磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）途径和促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径15。IFN-通过结合与IFN-/受体不同的受体而发挥作用，并介入一个不同但有重叠的JAK-STAT通路的信号传导（图1-2）。参与IFN-信号传递的受体主要有：IFNGR、Jak1、Jak2及STAT1。有活性的IFN-形成同源二聚体，结合到两个IFNGR1，IFNGR2二聚体上，形成对称性传递复合体。受体亚基在细胞内的结构与胞内非活性Jaks紧密相连，使Jak1和Jak2再在自主磷酸化和转移磷酸化作用下依次活化并与受体结合。所形成的复合体对IFNGR1近C-末端含酪氨酸的一段基序磷酸化，使其成为STAT1的锚定位点。位于STAT1 C-末端的两个酪氨酸残基被激酶磷酸化后从受体上脱离，这个激酶与受体相连，形成一个同源二聚体转移到核内，结合到IFN-诱导基因的特异序列上（gamma激活序列，GAS），激活基因的表达。图1-1 上图展示了在病毒感染过程中，人类细胞第一次产生的I型干扰素（以IFN-为例）在抗病毒过程中起作用的2步信号传导途径图1-2 IFN-信号通路示意图3鱼类干扰素调节因子的研究进展IRF家族最初因能够结合在I型IFN的病毒诱导类增强子原件上，诱导IFN的表达而被发现并被命名。随着研究的深入，发现IRF除了在IFN的转录调控、病原体的免疫反应中起重要作用外，它还在细胞因子的信号转导、细胞的增殖调控以及造血干细胞的发育分化中起重要作用。“IRF不仅仅是IFN的调节因子了!18”目前，在脊椎动物中已经发现10种IRF和几种病毒来源的IRF（v-IRF），而在鱼类中仅有5种干扰素调节因子的成员的基因被克隆出，包括IRF-1、IRF-2、IRF-3、IRF-6、IRF-7。3.1鱼类干扰素调节因子的分类及分子结构IRF是一类结构上保守的转录因子家族，IRF的N端的前115个氨基酸残基包含DNA结合域（DNA binding domain，DBD），含有保守的4-6个色氨酸重复，具有特征性的螺旋-转角-螺旋结构，通过DNA结合域，IRF可以结合相似的DNA序列（干扰素刺激反应元件，ISRE或IRF-E），ISRE首先是在编码I型干扰素基因的启动子上被鉴定出来，也在其它免疫基因及瘤形成基因的启动子上被发现。除具有DNA结合域，IRF还有IRF相关结构域（IRF association domain，IAD），丝氨酸富含域（Serine-rich domain，SRD）等多种功能性结构域等。1998年，第一个鱼类IRF基因在褐牙鲆中被克隆出来，但很难仅从序列同源性和基因表达模式断定被克隆出来的褐牙鲆IRF是IRF-1还是IRF-2。研究发现，IRF-1和IRF-2结构相似，功能相反，因为IRF-2的N末端DNA结合区与IRF-1的N末端高度同源，而C末端部分则不同，他们竞争性的结合相同的顺式作用元件。Ordas等分别从大菱鲆肾组织和金头鲷脾组织中分离到2种IRF-1序列：IRF-1a和IRF-1b，大菱鲆IRF-1a序列和IRF-1b序列存在4个核苷酸的差别，因为在鱼类的其他基因上也存在类似的情况，它们是来自两个不同的基因位点，而不是同一基因的不同拼接变异体23。在乌醴中，三种干扰素家族的成员IRF-1，IRF-2，IRF-7基因以及它们的启动子序列被克隆出，研究发现，乌鳢的IRF-1基因含10个外显子；IRF-2包含9个外显子，IRF-7全长包含10个外显子，不同于人类的IRF-7a基因的是在5UTR区具有一个内含子。在这三种干扰素调节因子的结构中发现，乌鳢的IRF-1和IRF-2基因包含了结合NF-B和Sp1的区域，IFN-的激活域（GAS）也在乌鳢的IRF-1和IRF-7启动子序列中被找到17。3.2鱼类干扰素调节因子的作用哺乳动物中，干扰素调节因子成员的功能各不相同，作为多功能转录因子，分别在干扰素的转录调控、病原体的免疫反应、细胞因子的信号转导、细胞增殖调控、造血干细胞和淋巴细胞的发育分化等方面起到非常重要的作用。IRF最首要的功能是诱导IFN的产生，IRF-1、IRF-3、IRF-5、IRF-7和IRF-9等诸多IRF，是病毒诱导产生IFN-I必需的转录因子。研究发现IRF-1表达水平的增加能够诱导STAT1、STAT2和IRF-9的表达，并能增强IFN-诱导细胞进入抗病毒状态。IRF-1和STAT1基因及其编码蛋白之间相互作用的分子机理，表明了细胞内存在放大的信号的通路，这种通路能够控制细胞对干扰素信号的反应。IRF-3和IRF-7在病毒感染的早期和病毒感染的晚期的干扰素信号传导的过程中起了关键的作用，而IRF-7除了通过诱导干扰素参与细胞抗病毒防御外，还是一种干扰素刺激蛋白（ISG），本身也能直接与病毒基因启动子或病毒蛋白相互作用，对病毒基因的表达和病毒的复制进行调节21。IRF-5介导病毒信号转导，诱导IFN-和IFN-基因的表达，并可以取代IRF-7诱导IFN-基因的表达作用。IRF-1可以通过转录激活一系列的靶基因而发挥其抑癌作用，而IRF-2可以抑制这些基因的表达，因此IRF-1和IRF-2的表达失衡导致肿瘤的形成。IRF-8又称为干扰素保守序列结合蛋白（interferon concensus sequence binding protein, ICSBP），主要表达于造血系统细胞中，通过促进髓系分化和调节对白血病细胞的免疫反应而与人类的髓性白血病发病密切相关。干扰素调节因子在淋巴细胞分化过程中也发挥了重要的作用，IRF-1调控I类辅助型免疫反应，IRF-4与IRF-1的功能相反，能诱导TH细胞向TH2细胞分化，调控II类辅助型免疫反应而IRF-4在B细胞分化过程中也起到重要的作用。在鱼类中，关于IRF的研究非常有限，功能研究主要集中于IFN的转录调控，抗病毒反应的方面的研究，对IRF家族成员多样性和功能的研究尚待进一步开展。Cai等克隆了褐牙鲆IRF-1基因（JFIRF-1）并构建了重组质粒，获得的上清液能够降低感染弹状病毒（HIRRV）和疱疹病毒（VHSV）滴度。研究证明，上清液中含有JFIRF-1诱导细胞进入抗毒状态并产生细胞因子类似物，因此JFIRF-1可用于DNA疫苗研制的辅佐剂的，在褐牙鲆的培育中发挥重要的抵抗病原体的作用。另外，还有学者对虹鳟IRF-1和Mx1基因启动子活性进行了研究。以虹鳟IRF-1a启动子构建的鱼类特异性DNA质粒载体，能够使IHNV病毒的G基因得到表达，研究发现这种IRF-1a启动子能够在老鼠NIH-3T3细胞中激活，也可以用于DNA疫苗的研究。Collet等将虹鳟IRF-2基因上游启动子克隆到报告基因载体pGL3-basic中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定试验，证明IRF-2基因上游启动子具有较强的启动子活性。体外研究表明，未受诱导物刺激的乌鳢头肾细胞表达IRF-1、IRF-2和IRF-7，经PolyI：C刺激后，它们的表达量都显著提高17。大西洋鲑TO细胞经鲑鱼贫血病毒（ISAV）感染后，STAT1快速合成，而IRF-7的转录上调时间较晚，提示ISAV病毒能够通过抑制IRF-7的转录而抑制IFN系统的抗病毒作用。PolyI：C能够诱导IRF-2在虹鳟和鳜鱼中表达。2008年，Holland从PolyI：C刺激的虹鳟单核细胞系（RTS-11）中克隆出了鱼类的第一个IRF-3基因，发现了IRF-3在抗病毒过程中发挥了重要作用。3.3鱼类IRF-3的分子结构哺乳动物的IRF-3基因编码427个aa组成的、分子量为55kDa的蛋白质，由3个部分组成：DNA结合域（DNA binding domain，DBD），转录活性域（Transactivation domain，TAD），反应结构域（Response domain，RD）（图1-3）。IRF-3的N端的115个氨基酸是DBD，内含特异的由由的10-18个氨基端间隔的5个重复的色氨酸残基，通过DBD IRF-3能结合到靶基因启动子上游保守IFN刺激应答元件（ISRE），在大多数IFN诱导的基因上的序列为AGTTTCNNCNY（其中N代表任意碱基）。干扰素的基因本身启动子上游存在ISRE，提示IRF-3能直接调控干扰素的表达。IRF-3蛋白的116到394位氨基酸是IRF-3的TAD，包括一段入核序列（Nuclear localization sequence，NLS，75-88aa）、一段出核序列（Nuclear export sequence，NES，139-150aa）、一段脯氨酸富含区（Proline rich segment，Pro，151-197aa）和一段IRF相关结构域（IRF association domain，IAD，199-394aa）19。通过NES和NLS，IRF-3实现了在细胞核和细胞质内的转移而有效实施调节功能。IRF-3能够通过TAD部分发挥其转录调节活性功能，TAD两侧有两个能相互作用的自身抑制结构域（Autoinhibitory domains，AID）分别位于IRF-3 C端380-427aa处和98-240aa处，覆盖了DBD和脯氨酸富含区。在未受病毒感染时，这两个AID能相互作用，使IRF-3形成一个封闭的构象，遮蔽IAD、DBD和核定位信号（NLS），防止未感染病毒时细胞浆内的IRF-3磷酸化转移至细胞核与DNA结合，当被病毒感染后，IRF-3通过IAD形成二聚体，入核发挥转录活性。若去掉这两个AID，即使无病毒刺激，也可使IRF-3与DNA结合，从而表现出低水平的转录活化功能。IRF-3的C末端区394-427个氨基酸是具有调节功能的RD，含多个磷酸化的位点，受多种激酶的调控，对其生物学活性的发挥起了重要的作用19。图1-3 IRF-3的分子结构示意图3.4鱼类IRF-3在免疫反应中的作用机制由于模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）的发现，IRF作为重要的免疫细胞活性调节因子受到关注，PRR的作用就好像是搭建了一个“平台”连接起了先天性免疫和适应性免疫。PRR识别病源相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如脂多糖（LPS），病毒核酸等。在宿主细胞中，PRR和PAMP结合诱导启动特殊的基因表达程序，这些程序的不同与入侵病毒的类型、位置有关，从而诱导相应的免疫反应来清除特殊的病原体。现已发现两种不同的PRR：跨膜PRR，称为Toll样受体（TLRs）；胞质PRR，包括维生素酸诱导基因I（retinoic-acid-inducible gene I，RIG-I）家族（包括黑素瘤分化相关基因5（MDA5）和RIG-I），干扰素诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR），和核苷酸结合域蛋白（NOD）。这些不同的识别体系依赖于病原体的属性和细胞的类型而被激活，从而启动不同免疫反应。在这些反应中，IRF-3作为调节因子发挥重要的作用。细胞感染了病毒（RNA病毒或者DNA病毒或者胞内细菌），能够通过一个特殊的胞质体模式识别系统引起先天性免疫反应。RNA病毒中的dsRNA与胞质PRR受体RIG-1或者MDA5相结合，诱导RIG-1或者MDA5上的半胱氨酸蛋白酶补充域（caspase-recruitment domain，CARD）与线粒体膜上的RIG-1或者MDA5的接头蛋白的CARD样区域相结合（CARDIF/IPS1/MAVS/VISA）。接头和受体结合后导致TBK1的激活，TBK1是肿瘤坏疽因子受体相关因子（TRAF）家族成员相关核因子B（NF-B）催化剂结合激酶124。有活性的TBK1诱导IRF-3特殊的丝氨酸残基磷酸化，使IRF-3形成同源或异源二聚体，后进入细胞核中，激活I型IFN的转录。IRF-3在IFN-I的正反馈调节中发挥了重要的作用。在RNA或者DNA病毒感染的早期，IRF-3的特殊的丝氨酸位点被磷酸化，从而使IRF-3同源或异源二聚体化，后二聚体转移到细胞核中诱导趋化因子（包括CXCL10）的表达，并且使少量的IFN-和IFN-表达。IRF-3在I型干扰素的诱导过程中起了重要的作用。分泌的IFN通过自分泌和旁分泌的方式结合并且激活I型干扰素受体（一种异源二聚体IFNAR1和IFNAR2），IFN与受体的相互作用引起IFN刺激基因因子3（ISGF3；转录信号转导和激活因子1（STAT1），STAT2和IRF9组成的异源三聚体），能够进入核中然后诱导IRF-7基因的转录。新合成的IRF-7的激活，病毒核苷酸通过PRR的识别，使大量的IFN-和一些IFN-蛋白表达，从而形成一个正反馈循环（IFN-IIFN-I诱导基因）。RIG-I和MDA5也能被I型IFN诱导，从而能够对正反馈的调节起了作用20-21。通过TLR介导的信号途径能广泛的被分为2类：依赖骨髓分化初级反应蛋白88（MyD88）的信号途径和非依赖MyD88的信号途径。除了TLR3，所有的TLR能激活依赖MyD88信号途径。相反，TLR3和TLR4激活非依赖MyD88的信号途径。这两种途径都跟两种重要的下游途径相连：NF-B途径，有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径。大量的证据显示IRF3和IRF7也能被依赖MyD88的途径和非依赖MyD88途径激活，并且对TLR诱导的特殊基因的表达程序起作用。TLR4信号途径至少通过4个接头：MyD88，Toll/IL-1受体（TIR）区域包含接头蛋白（TIRAP），TIR区域包含接头蛋白诱导IFN-（TRIF）和TRIF相关接头分子（TRAM）。TRAM-TRIF调节IRF3的活化。TRAM通过NAP1（NAK相关蛋白1）和TRAF3与TBK1相结合（Akira et al，2006），然后TBK1磷酸化IRF3（或者IRF7）。磷酸化的IRF3形成同源二聚体转移到核中，在核中诱导IFN基因和其他基因，例如编码CXCL10的基因。位于线粒体上的IRF7与MyD88相结合，调节I型IFN基因的表达。TLR9与具有非甲基化CpG基序的DNA捆绑，IRF7结合到MyD88上被一种蛋白激酶层激活，这个蛋白激酶层包括IL-1受体相关激酶4（IRAK4），IRAK1和NF-B抑制剂（IB）激酶（IKK）。IRF7的相同的激活的发生也随着TLR7跟单链RNA的激活。TRAF6和TRAF3已经显示能够与IRF7结合，通过基因敲除试验发现所有的分子对这种信号途径起了重要作用。4.本项研究的目的及意义大菱鲆生长迅速、肉味鲜美。在我国北方沿海养殖得到了迅速发展，产生了巨大的经济效益。随着大菱鲆养殖规模的迅速扩大，由于病毒性的毒害所引起的经济损失也日益突出。干扰素（INF）是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白。干扰素系统作为非特异性免疫系统的重要组成部分，可以在几小时之内对病毒感染起到抵抗作用，是脊椎动物抗病毒感染的重要系统。INF基因的表达受干扰素调节因子调节，并经IRFs及干扰素刺激性应答基因产物介导，激活相关信号转导途径而发挥其生物学效应。IRF家族成员的功能各不相同，作为多功能转录因子，分别在INF的转录调控、病原体的免疫反应、细胞因子的信号转导、细胞增殖调控和造血干细胞的发育分化等方面起到了关键作用。干扰素调节因子-3（IRF-3）在调节干扰素和干扰素刺激基因的转录过程中起了非常重要的作用。上述研究旨在为深入了解鱼类IRF-3的功能和干扰素系统的信号转导途径、开发基于IRFs的抗病毒药物和开展相关的转基因抗病育种等工作积累科学资料。第二章 大菱鲆的IRF-3的全长cDNA克隆及序列分析鱼类的干扰素存在于血液或粘液中，具有非特异性抵抗作用的可溶性蛋白分子，能够诱导抗病毒蛋白的产生。IRF最重要的功能是诱导IFN的产生，IRF-3是病毒诱导产生IFN必需的转录因子，在抗病毒感染性免疫反应中发挥重要作用。本文以大菱鲆为研究对象，拟采用同源克隆以及RACE的技术，根据已知的IRF-3基因序列的保守特征设计引物，进行RACE扩增，从大菱鲆的头肾组织中获得IRF-3基因cDNA的全长，利用生物学软件进行序列分析及进化分析，为进一步研究IRF-3基因在大菱鲆中各个水平上的表达调控，以及探索IRF-3在鱼类中的生物学功能提供序列基础。1实验材料1.1实验动物、菌种及质粒在青岛市南山市场购买体重500g的大菱鲆，在实验室室温条件下生活一周，确认健康后待用。Ecoli DH5菌株，由实验室保存。pMD18-T Vector试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司（以下简称TaKaRa公司），全长2692bp，含氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。1.2仪器设备H2050R-1高速冷冻离心机湘仪离心机仪器公司产品紫外分光光度计Gene QuantTMPCR扩增仪 杭州博日科技有限公司DYY-水平电泳槽北京六一仪器厂DYY-5稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂紫外凝胶成像系统KODAK恒温金属浴 杭州博日科技有限公司CHA-S（A）往复式气浴恒温振荡器金坛市科系仪器有限公司SW-CJ系列超净工作台苏净安泰公司Adventure电子分析天平OHAUS公司产品DELTA320 pH计METTLER TOLEDO公司磁力加热搅拌器国华仪器自动灭菌锅 TOMY公司产品电热恒温干燥箱上海实验仪器厂有限公司1.3溶液试剂RNAiso Reagent：购自TaKara公司；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase购自TaKara公司；SMART RACE cDNA Amplication Kit购自Clontech公司；Ex Taq PCR试剂盒购自TaKara公司；Biospin胶回收试剂盒购自BioFlux公司；质粒小量快速提取试剂盒购自Biomed公司；DNA marker：DNA2000购自Bioflux。氯仿，酒精，异丙醇，氯化钾，醋酸钾，氯化钠等所用化学试剂均为分析纯，来自国药公司的产品。琼脂糖（Biowest Agarose）购自Regular公司；DEPC，X-gal，IPTG购自Solzrbio公司；氨苄青霉素购自北京鼎国；蛋白胨（Peptone）购自杭州微生物时机公司；酵母提取物（Yeast Extract）购自OXOID；琼脂粉（AGAR）购自Hualvyuan生物。RNase-free水：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌；50TAE电泳缓冲液：Tris 242.2 g，用300 ml蒸馏水加热搅拌溶解后，加57ml冰乙酸，加入100ml 0.5M EDTA，pH 8.0，用冰乙酸调pH至8.0，工作液为1TAE；溴化乙锭（EB）储存液：将EB溶于100ml去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解，终浓度为10mg/ml，4避光保存；LB（Luria-Bertani）培养基：在950ml蒸馏水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加热搅拌至澄清，5M NaOH调pH至7.0-7.2，定容至1升，高压蒸汽灭菌；0.1M CaCl2溶液：无水CaCl2 1.144g，溶于100ml蒸馏水中，搅拌定容，高压蒸汽灭菌，-20保存；5%氨苄青霉素：将500mg氨苄青霉素溶于10ml双蒸水中，过滤除菌，-20保存；2%X-gal：将200mg X-gal溶于10ml二甲基酰胺（DMF）中，贮存于-20；10%IPTG：将1gIPTG溶于8ml蒸馏水中，定容至10ml，用0.22um的滤器过滤除菌，贮存于-20。2实验方法2.1大菱鲆头肾组织获取从大菱鲆体中获取头肾组织并迅速转移至液氮中冷冻保存，-80保存备用。2.2总RNA的提取及质量检测根据RNAiso Reagent试剂盒的操作说明抽提总RNA，具体实验步骤如下：向组织块中加入1ml RNAiso Reagent后，充分匀浆；在室温下静置5分钟，4条件下12000rpm，离心5min；取上清液转移入新的离心管中，加入氯仿200l，用力震荡至充分乳化，室温条件下静置5min；12000rpm，4离心15min；取上清液转移至另一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温下静置10min；12000rpm，4离心10min；弃去上清，加入1ml 70%的乙醇洗涤沉淀，12000rpm，4，离心5min，弃去乙醇；室温凉干沉淀2-5min，加入30ul RNase-free水溶解沉淀。用分光光度计测定RNA样品在260 nm、280 nm处的OD值，按RNA浓度=（OD260-OD320）稀释倍数0.04g/l计算RNA的浓度，视OD260/280等于1.82.0的样品为纯度合格，1.2%甲醛变琼脂糖电泳检测RNA样品完整性，RNA样品保存于-80备用。2.3cDNA第一链的合成根据SMART RACE cDNA Amplication Kit说明书操作，在一支0.5ml无菌离心管中加入5-CD PrimerA 2ul，SMART II A oligo 2ul，dNTP 1ul，模板RNA 2ul，加入无菌水至总体系为10ul体系，即为5RACE 逆转录体系；另一支0.5ml无菌离心管中加入3-CDs primer A 2ul，dNTP 1ul，模板RNA 2ul，加入无菌水至总体系为10ul体系，即为3RACE 逆转录体系。65反应5 min，立即冰上冷却5min。在两管中分别加入5 PrimerScript Buffer 4ul，Rnase Inhibitor 0.5ul，200U/ul PrimerScript Reverse Transcriptase 1ul，加DEPC水至终体系20ul，45反应90 min，70反应15 min。将得到的5-RACE-Ready cDNA和3-RACE-Ready cDNA保存于-20。2.4核心片段的克隆及测序2.4.1核心片段的PCR反应据己知的IRF-3核苷酸及氨基酸序列，选择保守性较高的区域对基因设计两对简并引物（如表2-1）。向50 ul 反应体系中加入10Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）5ul，dNTP Mixture（各2.5 mM）4ul，模板cDNA 1ul，上下游引物各1ul，Ex Taq（5U/l）0.25ul，补充无菌水（DDW）至终体积50ul。PCR反应条件为：94 3min，94 0:40min、50-55 0:30min、72 1:20min 共40循环，72 7:00min，4.0 5:00min。取1ul第一轮PCR产物作为模板，以3S-F2，3S-R2，退火温度54，进行二次PCR扩增，反应体系其他成分及反应其它条件同第一次PCR。以1TAE溶液配制1.2%的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭（EB），将PCR产物与6加样缓冲液混合均匀，加样5ul，140V，30min，取出凝胶，置于紫外成像仪观察。表2-1 核心片段PCR引物序列引物名称 引物序列（5-3） 引物用途 IRF3-hF1 ATHCCNTGGAARCAYGCNYT IRF-3核心片段PCR第一轮PCRIRF3-hR1 AGGRTCNGGCCAYTTYTCNCC IRF-3核心片段PCR第一轮PCRIRF3-hF2 GTAYTNATHTTYAARGCNTGGGC IRF-3核心片段PCR第二轮PCRIRF3-hR2 TCNGGCCAYTTYTCNCCNA IRF-3核心片段PCR第二轮PCR2.4.2 PCR产物的回收根据Biospin胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收，具体实验步骤如下：将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下置于1.5ml离心管中；加入500ml Extraction Buffer；50温育至凝胶融化；转入Spin column内，6000g离心1min，弃去接液管内液体；向Spin column内加500ul Extraction Buffer，12000g离心1min，弃去接液管内液体；加入750ul Wash buffer，室温静置2-5min，12000g离心1min，弃去接液管内液体；再次12000g离心1min，然后将Spin column转移到无菌的1.5ml离心管中；向Spin column内加30ul Extraction Buffer，室温静置3min；12000g离心1min，滤液中含有目的DNA片段。2.4.3 PCR产物与载体连接根据pMD18-T Vector试剂盒说明书进行TA克隆，具体步骤如下：在0.5ml离心管中加入1.0 ul pMDTM 18-T Vector *1，4.0ul 回收DNA，5.0ul Solution I，总体系10ul，16连接过夜。2.4.4 感受态细胞的制备与连接产物的转化挑DH5菌株平板划线培养于37，12-16h，挑取单菌落，转到5ml LB培养基中37，250rpm培养过夜；取lml菌液转移到200ml LB培养基中，37，250rpm，46h，测OD600值（0.4-0.7）；冰浴20min，4 4000rpm，离心10min；丢弃上清液，加入10ml冰冷的CaCl2（0.1Mol/L）悬浮，冰浴15min；4 4000rpm，离心10min；弃上清，加入10ml冰冷的CaCl2（0.1Mol/L）悬浮细菌；加入15的甘油，分装后立即放置于液氮中速冻5min，然后转移到80保存，用于转化。每个转化反应取200L感受态细菌放置于冰上；加入2ul连接产物，放置于冰上40min；42，90s，立即放置于冰上冷却；加入800ul LB液体培养基，37，170 r/min 培养60min；将培养液涂布于加入Amp/IPTG/X-gal的LB培养基平板；37倒置培养12-16小时。2.4.5 阳性克隆的鉴定根据pMDTM-18T Vector序列设计通用性引物，在0.2ml离心管中加入2ul 10Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），1.6ul dNTP Mixture（各2.5 mM），0.2ul Primer RV-M（50uM），0.2ul Primer M13-47（50uM），0.1l Ex Taq（5U/l），加入DDW至终体系20ul。挑取白色单菌落作为PCR反应的模板。PCR反应条件：94 3min，94 1min、60 0：30min、72 1：30min共36循环，72 7min，4 5min。1.2%的琼脂糖电泳检测目的条带，挑取阳性克隆送上海生工公司测序。2.4.6 核心片段序列分析将大菱鲆IRF-3核心片段PCR的产物测序后得到的序列，去掉载体序列后，用BLASTX程序搜索GenBank中的同源序列，对测序结果进行简单鉴定，确定得到的两个片段属于IRF-3亚家族，并且IRF-3核心片段与其它物种的IRF-3基因序列同源性高。其后利用Primer Premier 5.0，DNAMAN软件设计RACE实验所需的特异性引物。2.5 3RACE和5RACE片段的克隆及测序2.5.1 3RACE和5RACE克隆特异性引物设计我们根据已获得的大菱鲆的IRF-3核心片段基因序列，使用Primer Premier 5软件设计了用于巢式PCR扩增基因的3UTR的特异性引物，和用于扩增基因的5UTR的特异性引物（表2-2）。表2-2 IRF-3基因3-RACE和5-RACE PCR扩增用引物引物名称 引物序列（5-3） 引物用途IRF3-3F1 GACGACTGCCCCTACCTTCCAGAAG IRF-3 3RACE第一轮 PCRIRF 3-3F2 CTGAGCAACAGCAGCTGCAGAATC IRF-3 3RACE第二轮 PCRIRF 3-5R1 CTTCTGGAAGGTAGGGGCAGTCGTC IRF-3 5RACE第一轮 PCRIRF 3-5R2 GCATGAGACAACCTGGCTTTCTTGTG IRF-3 5RACE第二轮 PCR 2.5.2 3RACE片段的克隆及测序首先将3RACE cDNA稀释5倍作为模板，在0.2ml离心管中加入5ul 10Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus），4ul dNTP Mixture（各2.5 mM），1ul 3-RACE-Ready cDNA，1ul 3-3R1（10uM），5ul UPM（10uM），0.25ul Ex Taq（5U/l），加无菌水（DDW）至终体积50ul。PCR反应条件：94 3:00min，94 0:40min、67 0:30min、72 1:20min共40循环，72 7:00min，4.0 5:00min。实验管中所得PCR产物，稀释50倍，取1ul作为模板，以3-3R2，NPM，Tm=67，进行二次PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。3RACE产物回收、连接、转化和测序方法主要参考实验方法2.