酶工程第3章兰州大学酶工程酶的分离纯化.ppt

第三章酶的分离纯化 一 提取二 分离纯化 大规模提取纯化的特殊性 在选择酶的提取和分离纯化方法时 必须考虑到小规模工艺过程和大规模工艺过程之间的关系 酶的提取和分离纯化方法有多种 但并不是都适合大规模的操作过程 例如超声波处理 冻融 研磨等方法能有效地破碎细胞 但是扩大这些技术的使用规模 多数是不实用的 有些也效果不佳 胞外酶的提取 微生物产生的酶分为胞内酶和胞外酶 胞内酶还分为游离状态和膜结合状态两类 要得到胞内酶 必须首先破碎细胞 使酶从细胞内释放出来 进入提取液中 以后的分离纯化步骤就与胞外酶差不多了 一 提取 提取指的是使酶从细胞中释放出来 进入提取液的过程 提取一般在低温下进行 低温有利于保持酶的活性 也能减少蛋白酶对目标酶的水解 提取液要有适当的pH值和离子强度 通常用一定浓度的缓冲液作为提取液 根据情况还可以加入一些酶活性的保护剂和蛋白酶抑制剂 酶活性保护剂 牛血清白蛋白 BSA bovineserumalbumin 明胶 甘油 二硫苏糖醇 DTT 谷胱甘肽 GSH 巯基乙醇 金属离子 EDTA 蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟 PMSF 抗蛋白酶 antipain 亮抑酶肽 leupeptin 等 1 化学方法提取 1 碱 2 溶菌酶和EDTA 3 去垢剂提取 4 渗透冲击 1 碱提取 这种方法用在各种细菌的小规模和大规模提取中都相当成功 在提取治疗用的L 天冬酰胺酶时 将细菌置于pH11 12 5的碱液中处理20分钟可将酶提取出来 碱处理是否适用取决于目标酶在高pH下的稳定性 此法可以使蛋白酶失活 还可以减少医用酶制剂的热源污染 2 溶菌酶和EDTA提取 溶菌酶是用鸡蛋清作原料生产的商品酶 它专一水解细菌细胞壁粘肽 也叫肽多糖 部分的 1 4 糖苷键 细胞壁刚性强的革兰氏阳性细菌对这种酶的敏感性要比革兰氏阴性细菌高 因为细胞壁的刚性在很大程度上是来自细胞壁的粘肽 当细胞壁崩解后 最终使细胞外膜破裂的是提取液的渗透压 2 溶菌酶和EDTA提取 单独使用溶菌酶破碎革兰氏阴性细菌的细胞壁很难取得成功 EDTA是必需的添加物 因为EDTA能螯合维持细胞壁稳定必需的二价阳离子 可使革兰氏阴性细菌细胞外膜上的脂多糖释放出来 这样使溶菌酶可以进入并且作用于粘肽层 这项技术很少用于细菌酶的大规模提取 因为溶菌酶的价格较高 粗制鸡蛋清要便宜得多 而且常常同样有效 溶菌酶法是一种使细胞破裂的非常温和的方法 3 去垢剂提取 无去垢剂 detergent 存在时 膜结合酶大部分存在于离心后的沉淀里 而上清液里含量很低 去垢剂可以将膜结合酶溶解下来 所以提取膜结合酶时必须加去垢剂 离子型去垢剂的反应性比非离子型的强 会使酶变性 所以在提取膜结合酶时用非离子型去垢剂 常用的是曲拉通 在提取液中加入0 1 的Tritonx 100可将膜结合酶洗脱下来 离子型去垢剂 十二烷基硫酸钠 SDS 阴离子型 十六烷基溴化铵 阳离子型 非离子型去垢剂吐温 Tween 曲拉通 Triton 十二烷基麦芽糖苷 n dodecyl D altoside DM Tween20 TritonX 100 4 渗透冲击 渗透冲击 osmoticshock 法适用于从一些革兰氏阴性细菌提取酶 先用缓冲液洗菌体以去掉培养基 接着把菌体重新悬浮在含20 蔗糖的缓冲液中 平衡一段时间后 离心分离出菌体 这时细胞内的渗透压很高 将此菌体快速分散到4 的水中 细胞迅速吸水会引起某些细胞成分的释放 甚至细胞破裂 用渗透冲击法从大肠杆菌中提取卡那霉素乙酰转移酶和从费氏发光杆菌中提取虫荧光素酶效果很好 渗透冲击法不适用于革兰氏阳性细菌酶的释放 因为革兰氏阳性细菌的细胞壁刚性很强 2 物理方法提取 1 超声波 2 固体剪切 3 液体剪切 4 研磨或搅拌 5 突然降压法 1 超声波 超声波处理可以破碎细菌细胞 但也有些细菌如链球菌对超声破碎有很强的抵抗力 超声波处理的效率取决于多种环境因素 除处理时间外 还有悬浮介质的pH 温度和离子强度 实际应用中基本上是靠经验来选定处理条件 所用的条件随着产物和细菌种类的不同而改变 超声波破碎只适用于小量细胞的破碎 超声波破碎细胞的原理 超声波作用于液体会产生一种称为空穴作用的现象 在液体中出现压缩区和稀疏区 稀疏区中形成的空穴在稀疏区转变成压缩区时 空穴中产生的气泡被压缩到几千个大气压 紧接着气泡崩解形成冲击波 通常认为此冲击波是产生破坏力的主要因素 超声波细胞破碎仪可调节作用功率和作用时间 2 固体剪切 将菌体和磨料 硅藻土 混合 或将菌体冷冻到 20 冷冻生成的冰晶作为磨料 把它们放入金属块上的圆孔内 插上密接的金属塞 向塞顶施加150 230MPa的压力 此法能使特定的悬浮液中的细胞破碎达到很高的百分数 但不能用于大规模地破碎 固体剪切举例 有一种X压榨机 每分钟能加工100克酿酒酵母 这是把冷冻细胞从一个多孔圆盘挤出而使细胞破碎的 孔出口处的温度约为 22 细胞的破碎是由于受挤压的细胞通过小孔所产生的剪切力造成的 3 液体剪切 液体剪切与固体剪切原理相似 只是菌体是以悬浮液的形式压过小孔 小孔的孔径更小 压力为55MPa 137MPa 275MPa等几种 4 研磨或搅拌 研磨或搅拌用的磨料为直径0 1 0 2mm的玻璃珠 将玻璃珠和细菌悬液混合后 高速振荡或强烈搅拌 使细胞破碎 除以不同速度滚动的玻璃珠之间有研磨作用外 细胞和玻璃珠之间还存在互相碰撞 细胞破碎程度取决于搅拌时间 搅拌速度 细胞浓度 玻璃珠大小 玻璃珠的量等 现已证实 根据这些原理制造的生产装置是破碎某些 硬 细胞的最有效的方法 这些 硬 细胞包括变异链球菌 溶血链球菌 金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌 5 突然降压法 将细胞悬浮液装进高压容器 加高压至30Mpa甚至更高 打开出口阀门 使细胞悬浮液迅速流出 出口处的压力突然降低到常压 细胞迅速膨胀而破碎 爆炸式降压法 突然降压法的另一种形式称为爆炸式降压法 它是将细胞悬浮液装入高压容器 通入氮气或二氧化碳气 加压至5 50Mpa 振荡几分钟 使气体扩散到细胞内 然后突然排除气体 压力骤降 使细胞破碎 影响突然降压法破碎效果的因素 压力差 一般压力差要达到3Mpa以上 才有较好的破碎效果 压力降低速度 压力降低速度越快 破碎效果越好 压力若在瞬间骤降 可以达到爆炸性效果 细胞的种类和生长期 此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌的破碎效果较佳 最好使用对数生长期的细胞 3 提取液 1 盐溶液 2 酸溶液 3 碱溶液 4 有机溶剂 1 盐溶液 大多数酶都溶于水 在低盐浓度条件下 酶的溶解度随盐浓度的升高而增加 这称为盐溶现象 当盐浓度达到某一界限后 酶的溶解度随着盐浓度的升高而降低 这称为盐析现象 所以一般采用稀盐溶液提取酶 盐浓度一般控制在20 500mmol L 有少数酶 如霉菌脂肪酶 用不含盐的清水提取效果较好 盐提取液举例 固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶 蛋白酶等胞外酶 用140mmol L的氯化钠溶液或20 50mmol L的磷酸缓冲液提取 酵母醇脱氢酶用500mmol L的磷酸氢二钠溶液提取 6 磷酸葡萄糖脱氢酶用100mmol L的碳酸钠溶液提取 枯草杆菌碱性磷酸酶用100mmol L的氯化镁溶液提取 2 酸溶液 有些酶在酸性条件下溶解度较大 且稳定性较好 这时可用酸溶液提取 酸浓度也不能太高 常选用pH3 6的范围 如胰蛋白酶可以用0 12mol L的硫酸溶液提取 3 碱溶液 有些酶在碱性条件下溶解度较大 且稳定性好 这时可用碱溶液提取 如细菌天冬酰胺酶可用pH11 12 5的碱溶液提取 4 有机溶剂 有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 可以采用能与水混溶的乙醇 丙醇 丁醇等有机溶剂提取 如琥珀酸脱氢酶 胆碱脂酶 细胞色素氧化酶等 采用丁醇提取 效果良好 4 影响酶提取的主要因素 1 溶解度 2 温度 3 pH值 4 提取液的体积 5 材料的破碎程度 6 搅拌 1 溶解度 一种物质在某一种溶剂中的溶解度大小与该物质的分子结构及所使用的溶剂的理化性质有密切关系 一般说来 极性物质在极性溶剂中的溶解度较大 非极性物质则在非极性溶剂中溶解度较大 碱性物质在酸性溶液中溶解度较大 而酸性物质在碱性溶液中溶解度较大 2 温度 一般说来 适当提高温度 可以提高酶的溶解度 也可以增大酶分子的扩散速度 但温度过高容易引起酶的变性失活 对于一些耐热的酶 可以适当提高提取温度 但要注意蛋白酶对目标酶的破坏作用 可在提取液中加入蛋白酶抑制剂 在等电点条件下 酶分子的溶解度很小 不同的酶分子等电点不同 为了提高酶的溶解度 应避免使用pH与目标酶等电点相近的提取液 4 提取液的体积增加提取液的用量 可以提高酶的提取率 但提取液太多 会使酶的浓度降低 对进一步分离纯化不利 所以提取液的总量一般为原料体积的3 5倍 最好分几次提取 3 pH值 5 材料的破碎程度 含酶原料破碎后的颗粒越小 扩散面积越大 有利于酶的提取 6 搅拌适当搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒的表面 从而增大两相界面的浓度差 提高提取的效率 二 分离纯化 酶分离纯化的目的 酶的分离纯化是把目标酶与其它杂质分离开 使目标酶的纯度提高 酶的纯度用比活性来衡量 以电泳结果为单带 且进一步纯化不能提高比活性为达到均一 酶制剂的用途不同 对酶纯度的要求也不同 1 沉淀法 发酵液或提取液的体积一般很大 其中酶浓度较低 为了纯化操作方便 常需将酶液浓缩 纯化过程中有时也需要将酶液浓缩 浓缩除能缩小酶液体积外 还有一定的纯化作用 1 盐析法 不同的蛋白质在不同的盐浓度下溶解性不同 在低温下往酶溶液中慢慢加入某种盐 在不同的盐浓度下有不同的蛋白质沉淀出来 离心可获得不同的蛋白质沉淀组分 这叫分级沉淀 常用的盐是硫酸铵 因为它在低温下溶解度高 对大多数酶无毒 价廉 有时对酶还有稳定作用 盐析法的操作 在低温下往酶液中慢慢加入硫酸铵粉末并搅拌 使酶液中的硫酸铵浓度越来越高 不同的蛋白质在不同的硫酸铵浓度下沉淀出来 采用分级沉淀的办法 既能沉淀出目标酶 又能得到较高的纯化倍数 纯化后的比活性除以纯化前的比活性为纯化倍数 盐析法举例 从大肠杆菌菌株W3310提取青霉素酶是一个典型的例子 先加硫酸铵至20 浓度 w v 这时酶尚未沉淀 离心除去已沉淀的杂蛋白 再加硫酸铵至56 浓度 w v 沉淀出青霉素酶 酶纯化了5倍 同时使体积60升的样品缩减到重2 4kg的浆状沉淀物 2 有机溶剂沉淀 常用来沉淀蛋白质的有机溶剂是乙醇 甲醇 丙酮 不同的蛋白质在不同的有机溶剂浓度下沉淀出来 离心后的蛋白质沉淀尽快除去有机溶剂 以免酶在有机溶剂中时间太长而变性 3 三氯乙酸沉淀离心后的蛋白质沉淀尽快恢复到中性pH 以免酶在酸性环境下时间太长而变性 4 PEG沉淀 聚乙二醇对蛋白质有保护作用 用PEG分级沉淀纯化效果很好 PEG2000 4000 6000 8000都可以用 沉淀法要注意酶溶液的pH 离子强度 蛋白质浓度 温度等条件 热处理沉淀杂蛋白 对于耐热的酶还可以采用热变性的方法 高温下短时间处理 许多不耐热的蛋白质发生沉淀 离心后耐热的目标酶保留在上清液中 2 透析与超滤 透析是将酶液装在半透膜做成的口袋里 置于透析液中 酶液中的小分子物质可以透过半透膜进入到透析液中 而大分子的酶不能透过半透膜 超滤类似于普通的过滤 只是滤孔很小 滤膜的性质以其截留分子量来衡量 1 透析 将酶液装进透析袋中 置于适当的缓冲液中 在低温下搅拌 更换几次透析液 可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质 也能起到换缓冲液的作用 在装有酶液的透析袋外加固体Sephadex或PEG吸水 可浓缩酶液 2 超滤 超滤也是一种既可纯化又可浓缩的技术 它是利用不同孔径的超滤膜 截留下不同分子量的蛋白质 从而使分子量不同的蛋白质分离开 从而达到浓缩和纯化的目的 超滤的方式有压滤 真空吸滤和离心超滤三种 微孔超滤膜 微孔超滤膜类似于传统的滤膜 膜是刚性的 上面有随机分布的 平均大小为50 500nm的孔 这样 小分子会通过膜 而大分子则会被膜挡住 这种膜的缺点是中等大小的分子容易堵在孔中 使膜的通透能力逐渐下降 各向异性扩散膜 各向异性扩散膜的出现 超滤技术取得了突破性的进展 使超滤成为大规模分离和纯化酶的一种有用技术 各向异性膜是由一种高度加固的很薄的 皮 0 1 5 m 和作为支持物的支撑在下面的较厚 20 m 1mm 的多孔下层结构组成的 因为活性层很薄 因此具有极高的通透速率 而支持物的多孔性又使得任何通过膜的分子不被支持物所阻留 极化层 超滤时溶剂的流动可被浓度极化作用急剧降低 这是由于在膜表面形成一层排阻的溶质 从而阻碍溶剂流动 由此层造成的对溶剂流动的阻抗会逐渐增高 直到离开极化层的溶质扩散速率与溶质沉积速率相等为止 超滤装置设计的目标是使极化层保持在最小值 实验室的装置是采用搅拌方式增加溶质从极化层离开的速率来达到的 在较大的装置中 采用高速通过中空通道的方式来减少极化层的形成 蛋白质的超滤特性 蛋白质的超滤特性是可变的 Westmacott 1972 研究了大肠杆菌部分纯化的青霉素酶制剂的超滤特性 他使用一种截留分子量30 000的各向异性膜 由于缓冲液的pH和盐浓度不同 酶的通透量变化在1 6 到55 之间 最高通透量是在pH5 1 6 2下 接近酶的等电点 在pH8 0时 把缓冲液的浓度从1mmol L提高到30mmol L 通透量从1 6 增加到20 加EDTA也提高酶的通透量 而尿素有相反的作用 析滤 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素 可使纯化倍数得到明显的提高 例如大肠杆菌青霉素酶的纯度可提高7倍 超滤也可用于快速去除大量的低分子量溶质 如从酶液中去掉乙醇或脱盐 这种过程称为析滤 3 冰冻干燥 在一密闭容器中对结冰的酶液抽真空 可使水分升华并抽走 达到浓缩或干燥的目的 生物制品最后往往用冰冻干燥法制成成品 便于贮存和运输 冰冻干燥的成品使用时加入溶剂 缓冲液 后能迅速溶解 在冰冻干燥前酶液一般应先脱盐 否则会因形成低共熔混合物 导致干燥不完全 大量发泡和蛋白质变性 4 液 液双水相抽提 以往通常用离心或过滤的方法使酶从发酵液或菌体匀浆液中分离 但在中试或扩大生产时 或因要求相当大容量的高速冷冻离心机 离心力 10 000g 或因粘稠而又微细的物质堵塞滤器而致失败 70年代初发展起来的液 液双水相抽提技术不仅在一定程度上可解决此棘手问题 且可使酶与多糖 核酸等可溶性杂质分离 具有一定的提纯效果 有相当的实用价值 液 液双水相抽提的原理 抽提在制药 化工等行业是一种普遍应用和行之有效的分离提纯技术 这种抽提的相系统多系有机溶剂组成 由于大多数酶在有机溶剂中不仅溶解性能差 而且易变性失活 因此未能广泛地用于酶的抽提 早在1896年Beijerinck就发现了亲水性聚合物 hydrophi licpolymer 水溶液的不相溶性 incompatibility 今日的液 液双水相抽提技术即基于此 原理 续 当水溶液中含有一种或一种以上的亲水性聚合物时 若聚合物的浓度达到一定的阈值以上 就会形成不相混溶的 可分离的两相 这两相都是水溶液 亲水性聚合物对多数的酶有稳定作用 因此为酶提供了一个易溶而又不易破坏的抽提环境 细胞碎片 多糖 酯 核酸以及酶的性质不同 在两相中分配的情况也不相同 在多数情况下酶可与这些杂质迅速而有效地分离 原理 续 原则上多数的 但不是所有的 亲水性的天然或合成的聚合物水溶液在一定的条件下相混均可形成分离的双水相 如聚乙二醇 polyethyleneglycol 与右旋糖酐 dextran 或聚乙二醇与磷酸钾盐水溶液相混时均可形成分离的双水相 相的组成及其形成分离相时聚合物的浓度间的关系可用相图表示 双水相的相图 相图的说明 液 液双水相抽提的相图是一条双曲线 在双曲线的上方溶液可形成分离的两相 在下方则为均相 T点对应的坐标表示上相的组成 B点对应的坐标表示下相的组成 T1 T2 T3 及B1 B2 B3 称为节点 连接节点的直线称为节线 在同一节线上任何一点的上相及下相的组成相同 但相体积是不同的 相图的说明 C为临界点 在C点上相和下相的组成和体积都相同 加入极少量的水即可导致分离的两相转变成均相 当体系的总组成为P点时 体系分为两相 上相组成为T1 下相组成为B1 当P点在T1B1节线上移动时 上下两相的组成不变 但二者的体积发生变化 影响相图的因素 相图是选择形成分离两相时所含多聚物或盐的量的依据 有些相图可从资料中查得 也可通过试验获得所需的相图 除多聚物或盐的浓度可影响双相的形成外 多聚物的分子量 温度 放置时间及体系中存在的低分子物质等均可影响双相的形成 各种双水相系统 酶在两相中的分配系数 单位体积上相中酶的活性与单位体积下相中酶的活性之比K称为分配系数 K CT CB 式中CT为单位体积上相中酶的活性 CB为单位体积下相中酶的活性 多聚物或磷酸盐的量 pH值 离子强度及被抽提物的量均可影响分配系数 蛋白质的分配系数通常在0 1 10之间 分配系数的大小及上下相体积之比与分离效果有关 分配系数远大于1且上相体积较大时分离效果较好 收率较高 收率的计算公式 YT为上相收率 YB为下相收率 VT和VB分别为上 下相的体积 K为分配系数 双水相抽提的应用特点 常用的液 液双水相抽提系统有两种类型 第一类相系统由聚乙二醇和右旋糖酐组成 形成两相后上相为聚乙二醇富相 PEG richphase 下相为右旋糖酐富相 dextran richphase 第二类相系统由聚乙二醇和盐 常用的为磷酸钾或硫酸铵 组成 上相仍为聚乙二醇富相 下相为盐富相 无论哪种类型 各相均含有70 以上的水分 故为酶的溶解与抽提提供了适宜的环境 双水相抽提的应用特点 所需设备比较简单 仅需一个可使粗提液与两相系统充分混合及放置的贮罐和低速离心机或使两相迅速分离的分离器 操作方便 条件温和 在液 液双水相抽提中 由于聚乙二醇 右旋糖酐这类多聚物可作为酶活性的稳定剂 即使在常温下操作酶活性也不易损失 若相系统选择合适 收率一般可在80 90 此法不仅能使酶和细胞碎片 多糖 酯 核酸等杂质迅速分开 而且有一定的提纯效果 提纯倍数可为2 20倍 双水相连续抽提 液 液双水相抽提技术在开始时仅用于粗提液的处理 现已发展到用于后处理工艺的精制阶段 即经几次连续的液 液双水相抽提使产品获得相当高的纯度 如由保依地尼假丝酵母发酵产生的甲酸脱氢酶经四次连续抽提得到总收率为70 纯度大于70 的产品 此产品的质量符合NADH辅酶再生酶膜反应器用酶的需要 同时由于工艺简单 原材料成本低 产品价格大幅度地降低 5 凝胶层析 凝胶过滤 分子筛层析 排阻层析 凝胶层析的原理可以用3 氯 1 2 环氧丙烷交联的Sephadex凝胶 交联葡聚糖凝胶 来说明 所用的葡聚糖 也称为右旋糖酐 是由肠膜明串珠菌产生的产物 葡萄糖残基主要以 1 6 糖苷键连接 交联程度受所用的3 氯 1 2 环氧丙烷含量控制 从而决定了凝胶基质的水合 复得水 程度及凝胶的孔隙度 每单位干重凝胶复得的水越多 其孔隙度也越大 它所能分级分离的分子也越大 葡聚糖 交联剂之比越大 孔隙度也越大 反之孔隙度小 凝胶层析原理 若将一混合物上样到柱的上端 洗脱时 大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出 而小分子量的分子因能进入凝胶颗粒内部 延长了行进的路线而后流出 不能进入凝胶颗粒内部的最小分子的分子量称为该凝胶的排阻限度 在能进入凝胶颗粒内部的分子当中 分子量较大的先流出 分子量较小的后流出 这样就能将不同分子量大小的物质分开 将洗脱液分部收集 找出酶活性峰所在的管 即可得到纯化的酶 凝胶层析的原理 分子太大 都不能进入凝胶颗粒 大小不等的分子最早同时流出 分子太小 都能进入到凝胶颗粒的最小孔中 大小不等的分子最晚同时流出 有效分离范围 按分子从大到小依次流出 排阻限度 凝胶层析柱的再生 用洗脱液一直洗即可使柱再生 交联葡聚糖柱层析洗脱曲线 凝胶层析的分配系数 凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散分配的过程 分配系数Kav可简单地从以下公式得出 Kav Ve Vo Vt Vo 式中Ve 从柱上洗脱下溶质需溶剂的体积 Vo 外水体积 Vt 柱床的总体积 利用凝胶层析测定蛋白质的分子量 经验表明 Kav值与分子量的对数成反比 凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子外 还可用来测定蛋白质分子的分子量 先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其Kav值 以分子量的对数为纵坐标 以Kav值 或简单地以洗脱体积 为横坐标 作出标准曲线 再测出未知分子量蛋白质的Kav值 或洗脱体积 在曲线上可查出其分子量的对数 凝胶层析介质的型号 Sephadex有不同的型号 如SephadexG 100 SephadexG 25等 Sephacryl是交联的烯丙基葡聚糖和N N 甲叉双丙烯酰胺共聚物 如SephacrylS 100 S 200 S 300 S 400 S 500 S 1000等 后面的数字越大则孔隙度越大 凝胶层析介质的型号 近年来 除了上述Sephadex和Sephacryl外 还有多种材料用作凝胶层析的基质 如聚丙烯酰胺 BioGelP系列 琼脂糖 Sepharose2B 4B 6B和BioGelA系列 交联琼脂糖 SepharoseCL 2B CL 4B CL 6B 高度交联琼脂糖 Superose6 12 交联琼脂糖和葡聚糖 Superdex30 75 200 聚苯乙烯 琼脂糖 聚丙烯酰胺混合物 多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲酯等 一般是后面的数字越大孔隙度越大 但Sepharose相反 Sephadex的型号和特性 Sepharose的型号与特性 6 离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类 阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换基团 常见的阳离子交换基团有 SO3H COOH CH2COOH CM 等 阴离子交换剂的衬质上带有阴离子交换基团 常见的阴离子交换基团有 NH3 Cl 二乙基胺乙基 DEAE 等 离子交换层析分离蛋白质的原理 蛋白质分子上具有各种阴阳离子基团 在一定的pH和离子强度下 这些基团可与离子交换剂上的相应基团进行离子交换 使蛋白质分子吸附到离子交换剂上 改变pH和 或 离子强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来 离子交换层析分离蛋白质的原理 在一定的上样和洗脱条件下 不同蛋白质分子所带的净电荷和电荷密度不同 分子大小也不同 它们与离子交换剂的结合力不同 结合力较弱的先洗脱 elute 下来 结合力较强的后洗脱下来 从而达到分离的目的 洗脱的方式有单一溶液洗脱 阶段洗脱和梯度洗脱等 洗脱时可改变洗脱液的pH 也可改变洗脱液的离子强度 甚至二者同时改变 蛋白质的离子交换性质 在一般情况下 碱性蛋白质 等电点大于pH7 0 在pH小于等电点时带正电荷 被阳离子交换剂吸附 酸性蛋白质 等电点小于pH7 0 在pH大于等电点时带负电荷 被阴离子交换剂吸附 离子交换层析一般在偏中性条件下上样 离子交换剂衬质的种类 离子交换剂的衬质 也称载体 常见的有树脂 纤维素 cellulose 葡聚糖凝胶 Sephadex 琼脂糖凝胶 Sepharose 丙烯酸共聚物 Trisacryl 等 离子交换树脂 离子交换树脂物理性能稳定 蛋白质吸附容量高 装柱时沉降迅速 洗脱时允许高流速 但它的高吸附力在用于蛋白质纯化时却往往是缺点 因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件 所以不常用于蛋白质的纯化 离子交换纤维素 离子交换纤维素价格较廉 交换容量较低 一般为离子交换树脂交换容量的十分之一 洗脱条件温和 是常用的离子交换剂 离子交换Sephadex 离子交换Sephadex凝胶是在SephadexG 25或SephadexG 50上引入DEAE或CM基团制备成的 以SephadexG 50为衬质的离子交换凝胶具有高蛋白容量 但它们较软 而且在缓冲液pH或离子强度改变时会收缩或膨胀 不宜用于柱层析 离子交换Sepharose和Trisacryl 把DEAE或CM基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换Sepharose和Trisacryl 这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的 能确保高流速的珠形颗粒组成 具有高蛋白容量 它们在一般层析压力下不变形 更重要的是它们在离子强度改变时及极端pH下都不会收缩或膨胀 因此可在柱中再生 在大规模操作时这是很主要的优点 离子交换剂的再生 阳离子交换剂 0 5NHCl 0 5NNaOH 0 5NHCl 水 平衡阴离子交换剂 0 5NNaOH 0 5NHCl 0 5NNaOH 水 平衡 批式 离子交换 离子交换剂除用于柱层析外 还可用于 批式 batch 方法 它是把离子交换剂加到具有一定离子强度和pH的大体积酶液中 使酶交换到离子交换剂上 把吸附了酶的离子交换剂与溶液分开 再将离子交换剂放入小体积洗脱液中洗脱 这样不仅能使酶得到一定的纯化 还可达到浓缩的目的 批式 法的优缺点 批式方法操作简便 但一般来说 批式方法比柱层析纯化效果差 但对某些等电点离中性很远的酶来说 采用批式方法也能得到较好的纯化效果 如用CM 纤维素批式法可将等电点为pH8 6的L 天冬酰胺酶纯化100倍 7 疏水层析 Shaltiel等人在1972年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后 可选择性地吸附某些酶 进一步的研究表明 这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间的疏水力作用的结果 疏水层析的原理 酶分子的表面既有亲水性的基团或区域 也有非极性的疏水基团 如亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸 苯丙氨酸 或区域 疏水基团或区域可在酶分子的表面 也可处于亲水区域包围之中 形成疏水性的小孔或袋 在一定的条件下 琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用 使酶分子吸附到凝胶上 用能减弱疏水相互作用的洗脱液洗脱 就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来 疏水层析介质 目前常用的三种疏水层析介质是Butyl SepharoseCL 4B Phenyl SepharoseCL 4B和Octyl SepharoseCL 4B 三者中 Butyl SepharoseCL 4B的疏水作用力最弱 Octyl SepharoseCL 4B的疏水作用力最强 一般在不了解目标酶的疏水性能时 先试用疏水作用力较小的介质 影响疏水作用的因素 疏水作用对于温度的影响是十分敏感的 温度高时疏水作用力增加 反之则减少 溶质的性质也可影响疏水作用力 引起盐析作用的物质如NaCl Na2SO4等可增加疏水作用力 而引起盐溶作用的物质如盐酸胍 硫氰化钾 氯化四乙铵 尿素等则使疏水作用力减少 不同离子对疏水相互作用的影响 盐析效应增强盐溶效应增强 NH4 Rb K Na Cs Li Mg2 Ca2 Ba2 PO43 SO42 CH3COO Cl Br NO3 ClO4 I SCN 阳离子 阴离子 疏水层析的上样和洗脱条件 酶液在高盐浓度 如含有1 3mol L NH4 2SO4的缓冲液 时上样 然后用降低盐浓度的缓冲液 水或非极性溶剂如乙二醇等洗脱 用尿素或乙醇 丁醇洗即可再生 疏水层析介质的再生 疏水层析的优点 疏水层析有三个优点 a 由于在高盐浓度时吸附 硫酸铵沉淀后的样品不用脱盐可直接上样 b 洗脱条件温和 酶活回收率高 c 洗脱液盐浓度低 便于和后续纯化步骤相衔接 8羟基磷灰石层析 羟基磷灰石 hydroxyapatite HA 是一种白色颗粒 分子式为Ca10 PO4 6 OH 2 它能非特异性地吸附蛋白质 羟基磷灰石分离大分子的机理还不完全清楚 一般认为HA结晶表面外露的Ca2 和PO43 参与大分子的分级分离 酸性和中性蛋白质与HA上的Ca2 位点结合 高浓度NaCl KCl 或CaCl2的存在既不影响两者的结合 也不影响洗脱 碱性蛋白质是结合在HA的PO43 基团上 NaCl KCl 和CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱 羟基磷灰石层析的上样与洗脱条件 不同的蛋白质洗脱所需的条件不同 一般将酶液在低浓度磷酸缓冲液条件下上样 用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱 从而使各种蛋白质分离 酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用pH约6 8的低浓度磷酸缓冲液 30 120mmol L 碱性蛋白质一般用中浓度的磷酸缓冲液 120 230mmol L 进行洗脱 但也有一些碱性蛋白质用浓度很高的CaCl2也洗不下来 羟基磷灰石柱层析洗脱曲线 羟基磷灰石层析效果举例 用HA柱层析进行酶的大规模分离纯化可得到良好的效果 用16升的HA柱 从上样的脂肪嗜热芽孢杆菌抽提出的500g蛋白质中成功地分离出了6种酶 此外 从20kg大肠杆菌EM20031所得的蛋氨酰 tRNA合成酶 3 6 106单位 也在HA柱上进行了分级分离 产率为85 纯度提高了12倍 前述方法的总结 前述分离方法都是利用不同蛋白质分子的理化性质不同而将它们分离的 对每一种方法来说 都有许多其它分子因其在该方面的理化性质与目标酶相近而无法分开 但多种方法结合使用 可得到较纯的产品 9 亲和层析 1 原理 2 载体 衬质 3 配基 4 手臂 5 偶联方法 亲和层析的原理 亲和层析是利用蛋白质分子的生物特异性进行分离 因不同分子的生物特异性差别较大 所以分离效率高 酶与底物 酶与辅酶 酶与抑制剂 激素与受体 抗原与抗体之间都有特异的结合能力 将一方 称其为配基 偶联到载体上 即可特异性地与对应的另一方结合 亲和层析的过程 亲和层析的设计原理和过程可大致分为三步 一是选择合适的配基与不溶性的载体偶联 形成具有特异亲和性的分离介质 二是在适当的条件下 亲和介质选择性地吸附酶或其它生物活性分子 杂质与介质间没有亲和作用 故不能吸附而被洗涤去除 三是选择适当的条件使被吸附在亲和介质上的酶或其它生物活性分子洗脱下柱 载体 载体应具有以下基本特性 a 与蛋白质的反应弱 以避免非专一性吸附 b 偶联上配基后应具有良好的溶剂流速 c 含有可修饰的化学基团 偶联上配基后载体的结构不受破坏 d 可修饰的化学基团含量丰富 偶联后具有高吸附容量 e 在偶联和洗脱的各种条件下 机械和化学性质稳定 f 具有疏松的孔和亲水的网络结构 可使大分子自由通过 最好是球形 大小均匀 刚性的 琼脂糖和交联琼脂糖凝胶载体 珠粒状的琼脂糖凝胶 Sepharose 是在亲和层析中应用最广的载体 交联琼脂糖凝胶 SepharoseCL 4B 较其母体有更佳的理化稳定性 若在使用时需要更为激烈的条件 可考虑选用交联琼脂糖凝胶作为载体 但是 交联会导致供偶联配基的位点减少 吸附容量也会相应减少 配基 配基选择是否合适是关系到亲和层析成败的决定因素 可以作为配基的物质很多 可为较小的有机分子 也可为天然的生物活性分子 根据配基的性质 可将其分为两大类 特异配基 通用配基 特异配基 一般说来 酶和专一性抑制剂 抗原和抗体 激素和受体中的一方均为特异配基 以此类配基构成的亲和层析介质的选择特异性最高 分离效果也最好 缺点是此类配基多系不稳定的生物活性物质 在偶联时活性损失大 价格昂贵 成本高 specialligand 通用配基 以此类配基制备的亲和层析介质可用于一类物质的分离 如用NADH作配基可以吸附脱氢酶类 用ATP作配基可以吸附激酶类 用外源凝集素 一类特殊的蛋白质 可与某些细胞表面的特定糖蛋白结合 使细胞凝集 作配基可以吸附糖蛋白类 用通用配基制成的亲和层析介质的选择性低于用特异配基制成的亲和层析介质 但前者的应用范围较广 其中不少已有商品供应 故应用方便 价格也略较后者便宜 generalligand 亲和层析中常用的配基 配基与酶的亲和力 理想的配基在溶液中与酶结合后的解离常数应为10 8 10 4mol L 当解离常数大于10 4mol L时亲和性太低 不能有效地吸附酶 如酶与某些弱抑制剂之间的亲和性即属此情况 反之 当解离常数低于10 8mol L时亲和性太强 导致洗脱十分困难 如激素与受体间的亲和性即属这种情况 另外 配基的结构中应有多个功能基团 以保证在与载体偶联后不影响它和酶特异性结合的部位 手臂 或称连杆 用小分子配基直接偶联到载体上制备亲和层析介质时 尽管配基和酶之间的亲和力在适当的范围内 但其吸附容量往往很低 这是因为酶的活性中心常常深陷在内部 由于载体的空间障碍影响 配基与酶的活性中心无法接近 为改变这种情况 可在载体与配基之间插入一个手臂 一段链状结构 以消除空间障碍 此手臂不可太短也不可太长 太短不能起到消除空间障碍的作用 太长则往往使非特异性的作用如疏水作用增加 偶联方法 最常用的偶联方法是溴化氰法 在碱性条件下使溴化氰与多糖载体上的两个相邻羟基反应 产生少量不活泼的氨基甲酸衍生物和大量活化的亚氨碳酸酯衍生物 亚氨碳酸酯基团再与被偶联分子上的氨基反应 产生三种结合产物 其中异脲型为主要产物 溴化氰是剧毒物质 实验室操作时要特别小心 现已有溴化氰活化的SepharoseCL 4B供应 溴化氰活化法的反应式 活泼型 不活泼型 溴化氰活化后与酶的偶联 主要产物 洗脱 10 染料配基层析 自20世纪70年代起 人们陆续发现单氯 二氯三嗪类活性染料如CibacronBlueF3G A可以和一系列生物活性物质起作用 此作用类似于生物活性物质与其天然配基间的作用 实际上这些染料与生物活性物质之间并不存在任何生物学关系 因此称它们为假配基 pseudo ligand 或染料配基 dye ligand 由此发展起来的层析技术称为假亲和层析 pseudoaffinitychromatography 或染料配基层析 dye ligandchromatography 染料配基层析的优点 a 作为配基的染料是化学合成的 来源方便 价格也便宜 b 由于染料结构中有活性氯存在 故载体不需活化即可直接与染料配基偶联 操作较简单 c 染料配基层析介质与生物活性物质间的结合力较强 吸附容量较大 d 分离效果较好 收率一般也较高 染料配基层析的应用范围 由于染料配基层析有上述优点 发展十分迅速 应用染料配基层析可提纯脱氢酶类 水解酶类 乙酰基转移酶类 激酶类 磷酸核糖转移酶类 转氨酶类 磷酸化酶类 磷酸二酯酶类 脱羧酶类 合成酶类及人血清白蛋白 血凝因子 血清脂蛋白等 可见它的应用是十分广泛的 染料配基层析的应用范围 由于染料配基层析有较好的分离效果 应用该技术纯化的最终产品的质量可望符合各方面的要求 特别是医药和基因操作技术的要求 因此 染料配基层析是一种新型的 有广泛用途的分离提纯技术 目前市场上有多种规格的染料配基层析介质供应 染料配基的种类 染料配基的化学结构和性质不仅关系到它与载体偶联的能力 而且还直接影响它与生物活性物质的作用 常用的染料配基有以CibacronBlueF3G A为代表的蒽醌类活性染料及以ProcionRedH3 B为代表的萘类活性染料 这两类染料中均有三嗪环的结构 环上的氯十分活跃 可十分容易地与载体上的羟基或氨基发生亲核反应 因此染料配基与载体的偶联反应是在十分温和的碱性条件下进行的 CibacronBlueF3G A结构式 ProcionRedH2 B结构式 酶与染料配基之间的作用 当酶或其它生物活性物质被染料配基层析介质吸附时 它们之间的作用可能有三种情况 a 完全是特异性的亲和作用 b 特异性的作用与非特异性的作用 如静电吸引 离子交换等 综合作用的结果 c 完全是非特异性的作用 酶与染料配基之间的作用 CibacronBlueF3G A对于大多数与NAD 和NADP 有关的脱氢酶类及与ATP有关的激酶类的特异性结合作用是染料配基层析中的一种特殊现象 染料结构中的蒽醌部分被认为是某些生物活性物质相应的核苷酸部分的竞争性抑制剂 即类似于腺嘌呤部位的结构 染料配基层析的条件 酶吸附和洗脱的条件与缓冲液的种类 离子强度 pH 金属离子 特异配基等有关 应通过试验找出最佳的吸附和洗脱条件 以获得最高的纯化倍数和收率 染料配基层析的注意事项 a PH在应用染料配基层析时 系统中的pH极为重要 因为染料配基与酶之间除特异性的亲和作用外 还有非特异性的离子交换作用 在pH低于大多数酶的等电点时 非特异性的吸附增加 如在pH5 0时96 的血浆蛋白被BlueA凝胶吸附 而在pH9 0时仅白蛋白和脂蛋白被吸附 有时降低pH可增加染料 酶复合物的结合力和稳定性 有时降低pH可使洗脱解析加快 实际应用中应根据具体情况选择合适的pH pH对鼠肌肉丙酮酸激酶与ProcionRedHE3B Sepharose结合力的影响 染料配基层析的注意事项 b 金属离子少量的二价阳离子 尤其是Mg2 可明显地影响染料配基与某些酶的结合力 应用MatrexgelRedA柱层析纯化兔肌丙酮酸激酶 酵母己糖激酶 磷酸甘油激酶或兔肌激酶时 若缓冲液中含有10mmol LMgCl2 除兔肌激酶外其它三种酶与介质间的结合力明显增加 其它的二价阳离子如Ca2 Mn2 等及某些一价阳离子如K Na 等也有类似的作用 故可用金属离子调节和改变染料配基层析的选择性 在洗脱时若由于金属离子的存在而吸附过强时 可在洗脱液中加入低浓度的EDTA消除此影响 染料配基层析的注意事项 c 洗脱条件可用含适当浓度氯化钠 氯化钾 氯化钙 氯化铵 硫酸铵 甘油 乙二醇 尿素 硫氰酸钠或TritonX 100的缓冲液进行非特异性的洗脱 也可用含有底物 辅酶 或另外一些特异性的可溶性配基如NAD P NAD P H ATP ADP CoA FMN BlueA RedA等作特异性的洗脱 特异性洗脱可使染料配基层析的分离效果进一步提高 柱层析装置图 11 几种新型层析方法 径向流动层析法为上世纪80年代后期才发展起来的一种新的色谱分离技术 径向流动层析法的特点是 1 可以在低线性流速下更大流量操作 较传统层析法提高流速5 l5倍 提高效率 2 柱压低 3 广泛适用于离子交换 亲和 疏水等多种层析介质 4 便于线性放大 不仅可用于实验室的研究 放大中试并可用于大规模的生产分离和纯化 缺点是分辨率略低 A 径向流动层析 RadialFlowChromatography 径向流动层析柱 样品和流动相进口 流动相出口 层析介质 多孔管壁 Sepragen公司专利的径向柱 商品名为Superflo柱 B 灌注层析 传统的凝胶层析存在凝胶孔内流动相停滞区域产生的传质阻力 分离度低 尽管通过减小介质粒度和改进介质制备方法可减小这种影响 但无法完全消除 灌注层析就是采用大孔介质 在高流速下产生溶质随流动相穿透介质粒子的传质方式的新型层析技术 在研制用于过滤或作为催化剂载体的大孔聚合物颗粒 孔径达到100 1000nm 时发现 当膜的孔径达到500nm时 只要两边有微小的压力差 便可引发孔内的对流传质 如果在层析介质颗粒上有这种贯穿粒子的特大的对流传质孔 被分离的溶质便会随流动相一起迅速流过介质的大孔 而不是靠浓度梯度进行扩散传质 因而能加快传质过程 PerfusionChromatography 灌注层析介质 美国PerseptiveBiosystems公司开发的POROS系列灌注色谱填料是由苯乙烯和二乙烯苯通过悬浮聚合 乳液聚合等方式制备的多孔型高分子微球 其颗粒内部分布着两种结构的孔隙 一种是贯穿整个颗粒的特大孔 孔径在600 800nm之间 称为穿透孔或对流孔 另一种是连接这些特大孔的较小一些的大孔 孔径为500 150nm 孔深一般不超过1 m 被称为连接孔或扩散孔 虽然在穿透孔之间还存在若干扩散孔 它们不能形成快速对流传质 但这种孔的深度一般不超过1 m 扩散程很短 不会造成明显的传质阻力 而且扩散孔的存在恰恰提供了较大的表面积和柱容量 灌注层析的特点 灌注色谱法利用流动相和溶质的对流作用 降低了溶质在介质内滞留的限制 明显地缩短了蛋白质的分离时间 无论是分析色谱还是制备色谱 进行时得到的蛋白质质量 产量和产率都有所提高 根据这种色谱的特殊结构 在高流速下也不会因传质较慢而使谱带展宽 介质中随着连接的官能团不同 可分为反相 R型 强阴离子交换 Q型 和强阳离子交换 S型 等多种介质类型 穿透孔 扩散孔 C 膜层析 膜层析以多孔膜作为基质材料 膜上偶联配基 利用配基与蛋白质等目标分子之间的相互结合作用进行分离纯化 当样品以一定流速流过膜时 目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合 而杂质则透过膜孔流出 上样后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来 其纯化倍数可达数百乃至上千倍 轴向膜层析 径向膜层析 膜层析的特点 膜层析中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层 膜厚相当于床层高度 当床层体积一定时 这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速 从而提高分离速度和处理量 膜层析易于放大 便于实现大规模连续分离和自动操作 根据膜上偶联基团的不同 膜层析可