小檗碱抑制人子宫内膜癌细胞增殖及转移机制的研究.doc

小檗碱抑制人子宫内膜癌细胞增殖及转移机制的研究【摘要】目的 探讨小檗碱抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和转移的机制。方法 四甲基偶氮唑蓝法检测小檗碱对人子宫内膜癌Ishikawa细胞株的抑制作用;流式细胞仪观察对细胞周期分布的影响;ELISA法检测细胞培养上清液中炎性因子白细胞介素-8(IL-8)的浓度变化;应用Western印迹法检测经小檗碱干预该细胞48 h后,细胞核因子-B(NF-B)信号途径中p65的变化。结果 小檗碱可显著抑制Ishikawa细胞生长,呈时间剂量依赖性。小檗碱可阻滞细胞于G0/G1期。细胞培养上清液中IL-8的浓度随着干预时间延长而减少(P0.05)。小檗碱作用48 h后,细胞中NF-B p65表达明显下降(P0.05)。结论 小檗碱具有抗人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖作用,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制细胞产生IL-8,并能够阻断NF-B信号通路,从而抑制子宫内膜癌的转移。 【关键词】 小檗碱;子宫内膜癌;Ishikawa细胞株;细胞周期;细胞核因子-B;白细胞介素-8Abstract：Objective To study the effect of Berberine on human endometrial carcinoma cell line Ishikawa. Methods The changes of cell proliferation of Ishikawa cells treated with Berberine were observed by using MTT assay. The cell cycle expressions were determined by flow cytometry. The concentration of IL-8 in the supenmatant fluid was measured by ELISA. And NF-B p65 were determined by western blot assay. Results Berberine could inhibit the proliferation of Ishikawa cells in vitro significantly in a dose- and time- dependent manner (P0.05). The G0/G1 phase arrest was induced by treatment after 48 hours (P0.05). The concentration of IL-8 in the supenmatant fluid were decreased. Cellular NF-B p65 levels decreased in Berberine-treated cells after 48 hours (P0.05). Conclusion Berberine could inhibit Ishikawa cell proliferation, induce G0/G1 phase arrest, and inhibit the metastasis of endometrial carcinoma by interfering with the NF-B signaling pathway.Key words：Berberine;endometrial carcinoma;cell liner Ishikawa;cell cycle;NF-B;IL-8小檗碱是清热解毒中药黄连的主要有效成分,具有抗炎、抗高血压、抗糖尿病、抑制血小板聚集、抗肿瘤和免疫调节等起促进作用4。因此,本实验从细胞及分子水平探讨小檗碱对人子宫内膜癌Ishikawa细胞株的抑制作用及其对炎性因子IL-8和NF-B p65表达的影响,为临床应用小檗碱治疗和预防子宫内膜癌转移提供实验依据。1 实验材料1.1 细胞系人子宫内膜癌Ishikawa细胞,本院实验室保种传代。1.2 试剂及仪器DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素均购自北京迈晨科技公司。胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品。小檗碱,纯度99.5%,购自Sigma公司(B3251-10G)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Rnase A及碘化吡啶(PI)购自Sigma 公司。IL-8 ELISA试剂盒购于美国Abcom公司。兔抗人NF-κB p65(C22B4)抗体购自Cell Singnaling公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司。美国BD Facscalibur流式细胞仪,Olympus IX51倒置显微镜。2 实验方法2.1 细胞培养将人子宫内膜癌Ishikawa细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基,加入青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL, 37 、5% CO2条件下培养,倒置显微镜检查细胞生长情况以及细胞密度,每23 d消化传代1次,取对数生长期细胞进行实验。2.2 小檗碱的配置小檗碱溶解于少量二甲基亚砜(DMSO),再以PBS液(pH 7.4) 稀释成1 mg/mL的母液,过滤除菌,4 保存。使用前用DMEM/F12培养基稀释到所需浓度,其中DMSO终浓度0.1%。2.3 MTT实验取对数生长期Ishikawa细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,用DMEM/F12培养基制成单细胞悬液。调整细胞浓度为2×104/mL,接种于96孔培养板,每孔100 μL,于37 、5% CO2培养箱中培养24 h。待细胞至60%融合,且贴壁良好时进行实验。实验设溶剂对照组和药物处理组,药物处理组分别加入用DMEM/F12培养基稀释的小檗碱,终浓度分别为5、10、20、40、80、100、160、200 μg/mL。每一实验组每个时间点设6个复孔,继续培养24 h和48 h后,各孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,继续培养4 h,弃培养上清,每孔加入DMSO 150 μL,待结晶溶解后酶标仪上检测570 nm波长下的吸光度(A)值,计算细胞抑制率细胞抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。重复3次。2.4 流式细胞仪分析取对数生长期Ishikawa细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,用DMEM/F12培养基制成单细胞悬液。调整细胞浓度为1×105/mL,接种于6孔培养板,每孔1 mL。待Ishikawa细胞培养至接近融合密度,吸弃上清液,随机选取其中3孔加入终浓度为40 μg/mL的含小檗碱药液的DMEM/F12培养基5 mL,对照组3孔加入5 mL DMEM/F12培养基,继续培养48 h,分别收集细胞。用预冷70%乙醇4 固定12 h。离心弃固定液,PBS洗2次,加300 μL PBS,10 mg/mL的Rnase A溶液15 μL,混匀,37 孵育30 min,加1 mg/mL PI染液混匀,暗室中放置30 min后, 300目筛网过滤后流式细胞仪(Beckman)分析细胞周期。重复3次。2.5 ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-8表达取对数生长期Ishikawa细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,用DMEM/F12培养基制成单细胞悬液。调整细胞浓度为2×104/mL,接种于24孔培养板,每孔100 μL,于37 、5% CO2培养箱中培养24 h。待细胞至60 %融合,且贴壁良好时,随机分为空白对照组和药物实验组。空白对照组每孔加入100 μL DMEM/F12培养基,药物实验组每孔加入40 μg/mL的小檗碱100 μL,继续培养12、24、48 h,每组设6个复孔,分别取其上清液做IL-8 ELISA检测。按试剂盒说明书操作,以标准品的吸光值作为纵坐标,浓度作为横坐标,在坐标纸上画出曲线。根据标准曲线计算各实验孔检测指标的含量。重复3次。2.6 Western blot实验收集未加药处理的、20 μg/mL的小檗碱和40 μg/mL的小檗碱处理48 h的Ishikawa细胞,加入200 μL细胞裂解液,离心后弃去沉淀,Bradford 法测定蛋白含量后,将剩余蛋白样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液,沸水中煮5 min。取40 μg样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h后,加入兔抗人NF-κB p65一抗溶液(11000),4孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗溶液(15000),37 温育1 h,ECL暗室化学发光显影。重复3次。3 统计学方法所有数据以s表示,用SPSS17.0统计软件进行分析, 组间差异采用t检验,以P0.05为差异有统计学意义。4 结果4.1 小檗碱对Ishikawa细胞的增殖抑制作用不同浓度小檗碱可以明显抑制Ishikawa细胞增殖,且呈一定的时间-剂量依赖性(见图1)。小檗碱20 μg/mL和40 μg/mL 处理细胞48 h后,对Ishikawa细胞的抑制率分别为(37.292.89)%和(56.675.35)%。图1 小檗碱对人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的抑制作用4.2 小檗碱对Ishikawa细胞周期的影响40 μg/mL小檗碱处理Ishikawa细胞48 h后,G0/G1期细胞百分比上升,S期、G2/M期细胞百分比下降,具有统计学意义(P0.05),说明小檗碱可将Ishikawa细胞阻滞于G0/G1期(见表1)。表1 小檗碱处理48 h后2组Ishikawa细胞周期变化比较4.3 小檗碱对Ishikawa细胞上清液白细胞介素-8表达的影响与空白对照组相比,40 μg/mL的小檗碱作用12 h后未明显影响Ishikawa细胞上清液IL-8的表达,而作用24 h和48 h后均能明显抑制Ishikawa细胞上清液IL-8的表达(见表2)。表2 2组 Ishikawa细胞上清液IL-8含量比较4.4 Western blot检测细胞核因子-κB p65蛋白的表达经小檗碱处理48 h后的Ishikawa细胞核中NF-κB p65蛋白表达条带明显减弱,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P0.01)。小檗碱40 μg/mL组和20 μg/mL组的蛋白表达量分别为对照组的14.32%和42.03%(见图2)。A B CNF-κB p 65β-actin注：A.空白对照组;B.20 μg/mL小檗碱处理48 h;C.40 μg/mL小檗碱处理48 h图2 Western blot检测Ishikawa细胞NF-κB p65蛋白表达5 讨论根据病因学、组织学和生物学特征的不同,子宫内膜癌可分为两大类：雌激素依赖型和非雌激素依赖型,其中前者的发生与内源性或外源性雌激素的增高有关,占子宫内膜癌的大多数。我们选用的Ishikawa细胞株为雌孕激素受体均阳性的人子宫内膜癌细胞,是雌激素依赖型子宫内膜癌。本研究发现,小檗碱可以明显抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖,随时间延长、药物浓度增加而抑制率明显增加。40 μg/mL小檗碱作用48 h,对Ishikawa细胞增殖的抑制率达50%以上。此后药物浓度增加抑制率不再增加,趋于饱和状态。小檗碱可以将Ishikawa细胞阻滞于G0/G1期。我们在以往的研究中发现,子宫内膜癌患者多具有肥胖、高血压、糖尿病和盆腔炎病史者,因此认为子宫内膜癌与炎症反应具有相关性。研究表明炎性因子IL-8可能通过NF-κB信号传导通路促进肿瘤生长和转移。Mian等7发现NF-κB可以通过自分泌/旁分泌的形式建立反馈机制,对IL-8的表达或活化进行调节,从而促进肿瘤的浸润和转移。使用人抗白细胞介素-8抗体(ABX-IL8)不仅可中和人膀胱移行细胞癌细胞(BTCC)中分泌的IL-8,而且可调节NF-κB的表达和转录活动。李氏等8研究发现在子宫内膜组织由增生症到内膜样腺癌的发展过程中,NF-κB p65的核阳性染色比率逐渐增加,提示NF-κB p65蛋白可能促进了子宫内膜样腺癌的形成和进展。本研究发现,经小檗碱处理后的Ishikawa细胞核中NF-kB p65的表达明显下降,并且呈剂量依赖关系。40 μg/mL小檗碱可以显著降低Ishikawa细胞IL-8的分泌,并且该效应随着作用时间的延长而显著增强(P0.01)。由此我们认为小檗碱可能通过抑制NF-κB的活化、阻断NF-κB信号传导通路而抑制减少子宫内膜癌细胞分泌IL-8,进而抑制肿瘤的浸润和转移。综上所述,小檗碱可以抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖,将细胞阻滞于G0/G1期;通过抑制NF-κB信号传导通路的活化而抑制IL-8分泌,从而抑制子宫内膜癌的转移。其中抑制NF-κB信号传导通路的活化可能是小檗碱抗子宫内膜癌的作用靶点之一。今后,我们还将进一步研究小檗碱在体内对子宫内膜癌增殖和转移的作用,以及小檗碱抗子宫内膜癌的作用机制。【参考文献】 1 吴柯,周岐新.黄连抗肿瘤作用研究进展J.中国药房,2007,18(3)：226-229.2 Garcea G, Lloyd TD, Gescher A, et al. Angiogenesis of gastrointestinal tumours and their metastases-a target for intervention?J. Eur J Cancer,2004,40：1302-1313.3 Itoh Y, Joh T, Tanida S, et al. IL-8 promotes cell proliferation and migration through metalloproteinase- cleavage proHB-EGF in human colon carcinoma cellsJ. Cytokine, 2005,29：275-282.4 Karin M, Cao Y, Greten FR, et al. NF-kappaB in cancer：from innocent bystander to major culpritJ. Nat Rev Cancer,2002, 2(4)：301-310.5 Yoshimura T, Matsushima K, Oppenhe