黄伞子实体多糖免疫活性的研究-本科毕业论文

中中华华人人民民共共和和国国教教育育部部 东东北北林林业业大大学学 毕 业 论 文 论文题目 黄伞子实体多糖免疫活性的研究 学 生 王志强 指导教师 李德海 讲师 学 院 林学院 专 业 食品科学与工程 2006 级 1 班 2010 年 6 月 东北林业大学 毕 业 论 文 任 务 书 论文题目 黄伞子实体多糖免疫活性的研究 学 生 王志强 指导教师 李德海 讲师 专 业 食品科学与工程 2006 级 1 班 2010 年 3 月 15 日 题目名称题目名称 黄伞子实体多糖免疫活性的研究 任务内容 包括内容 计划 时间安排 完成工作量与水平具体要求 任务内容 包括内容 计划 时间安排 完成工作量与水平具体要求 研究内容 研究内容 研究黄伞子实体多糖纯化及免疫活性 实验部分采用水提醇沉法 料液比 1 20 提取时间 2h 提取温度 90 的提取条件 提取次数 2 次 合并两次的提取液 粗多糖 经 Sevag 中性蛋白酶 法除去蛋白质 并比较两种方法除蛋白的效率 多糖免疫活性 的测定指标为 小鼠脏体比 迟发型超敏反应 血清溶血素和小鼠巨噬细胞吞噬功能 研究计划与时间安排 研究计划与时间安排 2009 03 20 2009 04 15 查找与课题有关的文献和资料 2009 04 16 2009 05 20 翻译外文文献 资料整理 2009 05 21 2009 05 30 确定实验方案并进行实验材料及仪器药品的订购 2009 06 01 2009 06 10 黄伞子实体多糖的提取及多糖含量的测定 2009 06 11 2009 06 30 黄伞子实体多糖中去除蛋白效率比较及多糖含量的测定 2009 07 01 2009 08 10 黄伞子实体多糖动物免疫试验 2009 08 11 2009 08 20 实验数据的处理 2009 08 21 2009 10 10 撰写论文 修改论文至定稿 2010 05 11 2010 06 13 整理文档 准备答辩 完成工作量与水平要求 完成工作量与水平要求 要求在实验过程中 能够运用所学专业基本知识 基本理论独立的分析问题 解决 问题 能够熟练的查阅中英文资料 并准确把握资料的有效信息 最终独立的完成黄伞 子实体多糖纯化及免疫活性的研究 并对实验结果作基本的分析讨论 论文撰写符合东 北林业大学毕业论文要求 其中 参考文献篇数 20 篇以上 论文字数 20 000 字左右 外文翻译 3 篇以上 学科负责人意见学科负责人意见 东北林业大学毕业论文 2 签名 年 月 日 黄伞子实体多糖免疫活性的研究黄伞子实体多糖免疫活性的研究 摘 要 黄伞学名 Pholiota adiposa Fr Quel 在分类学上属真菌门 Eumycota 担子菌 亚门 Basidiomycotina 层菌纲 Hymenomy2cetes 伞菌目 Agaricales 球盖菇科 StropHariaceae 环锈伞属 GenusPHolipta 又名柳蘑 是一种药食同源植物 黄伞 子实体含有 21 64 粗蛋白 1 22 粗脂肪 8 04 粗纤维 4 11 多糖 5 88 灰分 本文探讨了黄伞子实体多糖的初步纯化及对小鼠免疫力提高的影响 黄伞子实体多 糖经中性蛋白酶和 Sevag 法联合除蛋白 其多糖含量为 72 88 试验动物分为五组 空 白组 模型组 黄伞子实体多糖高 400mg kg 中 200mg kg 低 100mg kg 剂量组 空白组和模型组每天灌胃等量生理盐水 给药组灌胃相应剂量的提取物 小鼠腹腔注射 120 mg kg 环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠模型 35d 后进行小鼠脏体比 迟发型超敏反应 DTH 碳廓清试验和血清凝集试验 结果表明黄伞子实体多糖能显著提高免疫器官 重量 P 0 05 P 0 01 提高 DTH 提高小鼠血清溶血素的效价 增强吞噬细胞吞噬能 力 P 0 05 关键词 关键词 黄伞 多糖 免疫活性 小鼠 Study of polysaccharide immunological active from the fruit body of Pholiota adipose Abstract Pholiota adipose Fr Quel is a plant belonging to Eumycota Basidiomycetes Homobasidiae A garicales Strophariaceau which is drug combination of fungal food It has been reported that fruit body of Pholiota adipose has abundant nutrients for instance it contains 21 64 crude protein 1 22 crude fat 8 04 crude fiber 4 11 polysaccharide 5 88 ash This study was designed to investigate the immunomodulatory effect of polysaccharides from the fruit body of PHoliota adipose Polysaccharides were administered orally at different dose 400 200 and 100 mg kg body weight to three group of mice 1 normal 2 NS control group and 3 the model of immune depressive group with cylopHospHamide respectively For evaluation of immunomodulatory effect the weights of spleen and liver delayed type hypersensitivity DTH the hemolysin in serum test and the carbon expurgation test were performed Polysaccharide content was up to 72 88 in the mixtrue extracted from fruit body of PHoliota adipose Polysaccharides at all tested doses heavy middle and slight significantly improved the weight of the mice s spleen and liver P 0 05 or P 0 01 DTH and the hemolysin in serum The level of the carbon expurgation in any dose groups has been significantly improved P 0 05 as well Key words PHoliota adipose polysaccharides immunomodulation mice 东北林业大学毕业论文 2 目目 录录 摘要摘要 Abstract 1 1 绪论绪论 1 1 1 黄伞简介 1 1 1 1 黄伞营养成分分析 1 1 1 2 黄伞栽培历史和发展现状 2 1 2 植物多糖的不同提取方法的研究进展 2 1 2 1 溶剂提取法 2 1 2 2 酶提取法 2 1 2 3 微波提取法 3 1 2 4 超声波提取法 3 1 2 5 其他提取方法 3 1 3 食用菌多糖的纯化 3 1 3 1 除蛋白 3 1 3 2 脱色 4 1 3 3 除小分子杂质 4 1 3 4 多糖的分级纯化 4 1 4 多糖及其功能性质 6 1 4 1 多糖的概念及来源 6 1 4 2 真菌活性多糖 6 1 4 3 活性多糖的生理功能 7 1 5 植物多糖的开发利用 9 1 6 论文研究的目的和意义 9 1 7 主要研究内容 9 2 2 材料与方法材料与方法 10 东北林业大学毕业论文 2 2 1 试验材料 10 2 1 1 试验原料 10 2 1 2 试验试剂 10 2 1 3 试验主要仪器 10 2 2 试验方法 11 2 2 1 黄伞子实体多糖的提取 11 2 2 2 黄伞子实体多糖的初步纯化 11 2 2 3 多糖含量的测定 11 2 2 4 动物 11 2 2 5 剂量选择与饲喂 11 2 2 6 免疫器官重量试验 12 2 2 7 迟发型超敏反应 DTH 12 2 2 8 血清溶血素试验 12 2 2 9 单核 吞噬细胞功能试验 12 2 3 统计分析 13 3 3 结果与讨论结果与讨论 14 3 1 葡萄糖标准曲线的制作 14 3 2 黄伞子实体多糖的初步纯化 14 3 3 黄伞多糖提高免疫力的研究 14 3 3 1 免疫器官重量试验 14 3 3 2 迟发型超敏反应试验 16 3 3 3 血清溶血素试验 17 3 3 4 单核 吞噬细胞功能试验 17 4 4 结论结论 19 4 1 黄伞子实体多糖的初步纯化 19 4 2 黄伞子实体多糖免疫活性的测定 19 4 3 试验建议 19 参考文献 致谢 东北林业大学毕业论文 1 黄伞子实体多糖免疫活性的研究黄伞子实体多糖免疫活性的研究 1 绪论 1 1 黄伞简介 黄伞学名 PHoliota adiposa Fr Quel 在分类学上属真菌门 Eumycota 担子 菌亚门 Basidiomycotina 层菌纲 Hymenomy2cetes 伞菌目 Agaricales 球盖菇 科 StropHariaceae 环锈伞属 GenusPHolipta 又名柳蘑 是一种秋季多生于杨 柳 及桦树上的大型真菌 在我国绝大部分地区皆有分布 1 黄伞具有较高的营养和药用价 值 除含有大量蛋白质外 已知在子实体表面有粘液状核酸物质 其有利于人体脑力和 体力的恢复 黄伞多糖对小鼠腹腔巨噬细胞有激活效应 对小鼠肉瘤和艾氏腹水癌有抑 制作用 可预防葡萄球菌 大肠杆菌 肺炎杆菌和结核杆菌感染 2 此外还有抗疲劳的 生化特性 3 食用菌多糖因大多具有独特的生物学活性而日益受到人们重视 其众多的 药用价值不断被发现和证实 已成为开发新一代营养保健品及生物制药的研究热点 1 1 1 黄伞营养成分分析 惠丰立等以1973年联合国粮农组织 FAO 和世界卫生组织 WHO 规定的必需氨基酸 均衡模式为标准 对黄伞深层发酵菌丝体与子实体中必需氨基酸组成及氨基酸进行了评 价 发现黄伞子实体中粗蛋白质 粗纤维和灰分的含量与 食物成分表 中一般食用菌 的含量相当 粗脂肪含量低于一般食用菌 多糖含量为14 11 高于一般食用菌 4 黄伞子实体中氨基酸种类齐全 18种 总含量与其他食 药 用菌相比较高 总氨基酸 中谷氨酸 天冬氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 缬氨酸和丙氨酸含量的比例较高 黄伞子实 体蛋白质的必需氨基酸总量6 32 非必需氨基酸总量为10 37 氨基酸总量为16 69 必需 氨基酸占氨基酸总量 E E N 的37 87 必需氨基酸与非必需氨基酸比值 E N 为0 61 已达到FAO WHO 1973 提出的理想蛋白质必需氨基酸 E 应达总量40 左右 EN值应在 0 6以上的要求 黄伞子实体中含有钾 钠 钙 磷 镁 铁 锌 锰等多种人体必需的 矿质元素 其中人体容易缺乏的微量元素铁 锌 锰含量较高 为一般食用菌的2倍左右 黄伞子实体中含有VB1 VB2和VPP 其中VB2含量为1 5mg 100g 高于47种干菇的平均含 量1 229mg 100g 此外黄伞子实体中还含有大量的麦角固醇 麦角固醇是VD2的前体 在 紫外线照射下可转变成VD2 黄伞子实体的营养成分较为齐全 除含有丰富的营养物质 如蛋白质 脂肪 纤维素及多种维生素和无机盐外 还含有氨基酸 多糖 麦角固醇等 多种生物活性物质 惠丰立 5 研究表明 黄伞深层发酵菌丝体与子实体粗蛋白含量较高 粗脂肪含量较低 并含有多种矿质元素及多种维生素 深层发酵菌丝体氨基酸总量比子实体高46 25 矿 质元素在深层发酵菌丝体中Na P Mg Zn含量高于子实体 但K Ca Fe Mn含量低 于子实体 深层发酵菌丝体VB1和VB2含量比子实体高 但VPP的含量比子实体低 黄伞 深层发酵菌丝体与子实体具有相近的营养组成 其中部分营养成分含量甚至超过了子实 体 因此具有较高营养价值和药用价值 由于黄伞人工栽培子实体生产周期长 产量低 东北林业大学毕业论文 2 而利用农产品的副产物 通过深层发酵技术工厂化生产黄伞菌丝体的产量高 成本低 周期短 具有显著优势 因此以深层发酵菌丝体代替子实体开发具有医疗保健功效的食 品 保健品或作为药品的原料是切实可行的 因此 黄伞不仅具有较高的营养价值 还 具有重要的药用价值 1 1 2 黄伞栽培历史和发展现状 黄伞作为著名的医用食用菌已众所皆知 但是有关黄伞提取多糖的纯化和多糖的高 级结构国内外也均未见报道 因此目前对黄伞多糖的研究还刚刚起步 仍有许多方面值 得我们去探索 对其固有的医药价值和特殊的药理功效却重视不够 有必要从医药学角 度进行深入系统的研究 6 今后 应在合理利用子实体资源的同时 着重功能性的应用开发 将黄伞资源的开 发研究真正列入科研的重要日程 1 2 植物多糖的不同提取方法的研究进展 1 2 1 溶剂提取法 溶剂提取法 7 是从植物中提取多糖的常用方法 溶剂提取法首先要考虑的因素是选 择溶剂 一般都应遵循相似相溶的原则 即极性强的有效成分选择极性强的溶剂 极性 弱的有效成分选择极性弱的溶剂 多糖是极性大分子化合物 应选择水 醇等极性强的 溶剂 在所有溶剂中 水是典型的强极性溶剂 对植物组织的穿透力强 提取效率高 在生产上使用安全 它能用于各种植物多糖 被广泛应用 用水作溶剂来提取多糖时 可以用热水浸煮提取 也可以用冷水浸提 水提取的多糖多数是中性多糖 一般植物多 糖提取多数采用热水浸提法 该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物 或者利用 多糖不溶于高浓度乙醇的性质 用高浓度乙醇沉淀提纯多糖 但由于不同性质或不同相 对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同 它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分 离 还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离 其中 以乙醇沉淀最为普遍 8 李宏燕 9 在紫菜粗多糖提取方式研究中 热水提取控制条件为 温度为20 100 水与紫菜的液固质量比 20 50 提取时间30 240min 最终得率为2 05 1 2 1 2 酸提取法 有些多糖适合用稀酸提取 并且能得到更高的提取率 孟宪元等 10 在茜草多糖提取 研究中 发现相对于水提 以稀酸提取茜草多糖 产品纯度较高 但酸提法有其特殊 性 只在一些特定的植物多糖提取中占有优势 目前报道的并不多 而且即使有优势 在操作上还应严格控制酸度 因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂 1 2 1 3 碱取法 与酸提类似 有些多糖在碱液中有更高的提取率 尤其是提取含有糖醛酸的多糖 8 及酸性多糖 如Hayashi Katsuhiko 10 发明了一种从绿色藻类中提取酸性多糖的方法 而 这种多糖用常规的热水法是无法得到的 同样 碱提优势也是因多糖类的不同而异 与 酸提类似 碱提中碱的浓度也应得到有效控制 因为有些多糖在碱性较强时会水解 11 另外稀酸 稀碱提取液应迅速中和或迅速透析 浓缩与醇析而获得多糖沉淀 1 2 2 酶提法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术 在多糖的提取过程中 使 用酶可降低提取条件 在比较温和的条件中 东北林业大学毕业论文 3 分解植物组织 加速多糖的释放或提取 此外 使用酶还可分解提取液中淀粉 果胶 蛋白质等非目的产物 常用的酶有蛋白酶 纤维素酶 果胶酶等 7 酶提法的优势越来越受到研究人员的关注 因此有众多关于各种酶在多种植物多糖 提取中的应用的报道 此外 新酶的开发利用也有着广阔的前景 1 2 3 微波提取法 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的电磁波 微波提取的原理是微射线辐射于溶 剂并透过细胞壁到达细胞内部 由于溶剂及细胞液吸收微波能 细胞内部温度升高 压 力增大 当压力超过细胞壁的承受能力时 细胞壁破裂 位于细胞内部的有效成份从细 胞中释放出来 传递转移到溶剂周围被溶剂溶解 此法提取时间短 提取率高 是强化 固液提取过程颇具发展潜力的一项新型辅助提取技术 王自军等 19 首次运用微波技术从白芥子中提取出多糖 反应速度大大加快 收率提 高 半枝莲 20 金樱子 21 运用微波技术提取多糖的高效性也相继被证实 1 2 4 超声波提取法 超声提取法是应用超声波强化提取植物多糖的方法 是一种物理破碎过程 超声波 是频率在20KHz以上的声波 对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用 当超声波 振动时能产生并传递强大的能量 引起媒质以大的速度加速进入振动状态 使媒质结构 发生变化 促使有效成分进入溶剂中 同时 超声波在液体中还会产生空化作用 即在有 相当大破坏应力的作用下 液体内形成空化泡的现象 空化泡在瞬间涨大并破裂 破裂 时吸收的声场能量在极短的时间和极小的空间内释放出来 形成高温和高压的环境 同 时伴随有强大的冲击波和微声波 从而破坏细胞壁结构 使其在瞬间破裂 植物细胞内 的有效成份得以释放 直接进入溶剂并充分混合 从而提高提取率 此外 超声波还产 生许多次级效应如热效应 乳化 扩散 击碎 化学效应 生物效应 凝聚效应等也能 加速植物有效成份在溶剂中的扩散释放 有利于提取 与常规提取法相比 超声波提取 可缩短提取时间 提高提取率 所以超声提取在植物多糖的提取中得到广泛应用 李军生等 15 发现 超声处理可使南瓜多糖的提取时间缩短 在一定范围内随着超声波 的使用功率的增大 提取所得的南瓜总糖 还原糖和多糖的产量也随之提高 温度与超 声波可以协同作用 共同提高南瓜多糖的提取率 1 2 5 其他提取方法 随着科学技术的进步 越来越多的提取方法应用到植物多糖的提取中 如超滤法 12 膜过滤法等 植物多糖的提取方法和技术在不断革新 对于同一种方法和技术又不断在不同的植 物多糖中研究 考察 本文仅为研究和生产工作者提供参考 在选取方法时 研究和生 产人员应当关注目标多糖的性质 特点 综合比较 进行实验 才能选取最佳方法和 工艺 1 3 食用菌多糖的纯化 现代研究普遍认为多糖类物质只有大分子才具有生物活性 因此要得到较纯的多糖 就必须去除粗多糖中所含有的无机离子 有机小分子 各种单糖类物质 色素和游离蛋 白等 食用菌多糖粗品脱蛋白的方法主要有Sevag法 三氯乙酸法 酶法等 前两者多作 用于生物多糖 Sevag法是经典的除蛋白方法 复杂 费时且样品损失较大 通过逆向流 水透析除去低聚糖等小分子杂质 这样得到的就是多糖的半精品 食用菌多糖纯化的方 法主要有分级沉淀法 季铵盐沉淀法 盐析法 金属络合物法 柱层析 超滤等 现在 东北林业大学毕业论文 4 关于多糖的分离 纯化以及组成分析的研究已经广泛展开 1 3 1 除蛋白 天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分共存 且分子量相近 另外糖常常与蛋白形 成糖蛋白复合物 使蛋白质的脱除更加困难 但也许正是结合了这部分蛋白质 多糖才 具有众多独特的生理功能 如各种蛋白质聚糖 糖蛋白具有生理功能一样 常用的除蛋 白质的方法有Sevage 法 三氯乙酸法 三氟三氯乙烷法 酶法等Sevag法为实验室常用 法 该法以正丁醇与氯仿 1 4 1 5 混合再进行萃取 蛋白酶法是目前认为较好的方 法 将蛋白质水解再透析去除 1 3 2 脱色 对于植物多糖可能会有酚类化合物而颜色较深 对其进行脱色可使其应用范围更加 广泛而常用的脱色方法有 离子交换法 氧化法 金属络合物法 吸附法 纤维素 硅藻 土 活性炭等 LDEA E 纤维素是目前最常用的脱色剂 通过离子交换柱不仅达到脱色 的目的 而且还可以分离多糖 1 3 3 除小分子杂质 选用不同规格的超滤膜和透析袋进行超滤和透析可以将不同分子大小的多糖进行分 离和纯化 22 该法在除去小分子物质十分实用 同时能满足大生产的需要 具有广阔的 应用前景 至此 得到的提取液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物 这样 得到的就是多糖的半精品 1 3 4 多糖的分级纯化 采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物 即是多分散性的而其不均一性表现 在化学组成 聚合度 分子形状等的不同 分级的方法可达到纯化的目的可按分子大小 和形状分级 如分级沉淀 超滤 分子筛 层析等 也可按分子所带基因的性质分级 如 按电荷性质分级的电泳 离子交换层析等 1 3 4 1 分级沉淀法 不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中溶解度不同 可用不同浓度的有机溶剂分级沉 淀分子大小不同的多糖 该方法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖 并逐渐应用于 更多的纯化领域 孟雅等 17 在马铃薯多酚氧化酶的提取纯化中发现 硫酸铵沉淀和凝胶 层析相结合的方法能够大大提高多酚氧化酶的活性 且在最佳 PH 值 7 0 和最适温度 30 的条件下多酚氧化酶的活性达到 1560U 程忠玲等 18 在海带中褐藻糖胶的提取中 研究 发现 在提取温度 70 PH 2 5 70 乙醇浓度提取 3h 提取率 7 3 乙醇分级沉淀法 提取率高于氯化镁法 1 3 4 2 季铵盐沉淀法 多糖能与一些阳离子表面活性剂和盐形成不溶性化合物 常用的季铵盐是十六烷基 三甲基胺溴化物 CTAB 及其碱 CTA OH 和十六烷基吡啶 CPC 一般地说 酸性多 糖或相对分子质量大的多糖首先沉淀出来 所以控制季铵盐的浓度能分离各种不同的酸 性多糖 该法可用于分离酸性及中性多糖 何伟珍等 在银耳多糖的提取分离与纯化 中发现 银耳水煮提取后 粗产品采用季铵盐沉淀法 纯化后精品中银耳多糖的含量达 76 28 刘群 20 在海带硫酸多糖的分离纯化研究中夜采用了季铵盐沉淀法 酶解海带液 东北林业大学毕业论文 5 的回收率达 60 提取率为 3 2 1 3 4 3 盐析法 常用的盐析剂有硫酸铵 氯化钠 氯化钾 醋酸钾等 主要应用于果胶的提取和纯 化 果胶中的羧基很容易与金属离子如钾 钠 铝等反映而生成盐 为此 要将果胶溶 液先调至一定的PH 加入适量的金属盐 使其与果胶中的羧基反应而生成果胶酸盐 由 于果胶酸盐不溶于水 因而在溶液中以絮状物的沉淀析出 经过滤后 用酸化的醇将金 属离子置换出来 而金属离子则形成可溶物而溶于水中 以达到 脱盐 再经过滤 干燥粉碎后而制得果胶 任吉君等 21 在提取红秋葵果胶的研究中 利用盐析法对红秋葵果实中的果胶进行了 提取 研究结果表明 明矾用量12g PH 2 0 水解时间60min 温度85 水量500ml条 件下 果胶提取量最高 可达5 375g 其中明矾的用量对果胶的提取量影响较大 孔瑾 等 22 在南瓜皮中提取果胶的技术研究中发现 料液比为1 7 萃取液的PH 值为2 萃取 温度为95 萃取时间为90min 并用硫酸铝作沉淀剂 果胶得率13 6 与酒精法相比 盐析法提取果胶具有成本底 得率高 果胶制品纯洁等特点 1 3 4 4 金属络合物法 金属络合物法是利用多糖能与铜 钡 钙 铅离子形成络合物而沉淀 常用的络合 剂有费林溶液 氯化铜 氢氧化钡和醋酸铅等 这种方法尤其重金属的影响 所以应用 的比较少 多应用于环境中污染物的检测 23 1 3 4 5 超滤法 超滤法是一种膜分离法 常用于除去多糖中的小分子物质 由于操作条件温和 不添加 化学试剂 不损坏热敏性物质而具优势 膜分离不仅节约能源 而且具有无污染且保留 生物活性成分的高效价 因而得到广泛的应用 不同的超滤膜具有允许不同相对分子质 量和形状的物质通过的性质 多糖溶液通过各种已知的超滤膜就能达到分离 近年来使 用外场强化使超滤效果得以提高 如王芳等 24 利用超滤法对绿原酸的提取 最终纯化液 干浸膏中绿原酸高达44 10mg g 李季文等 25 利用超滤法纯化葫芦巴中葫芦巴皂苷的工艺 研究 操作压力为2Kg m 2膜孔径10000 药液浓度为生药量1 0g m 1 药液温度为25 时纯化效果最好 膜分离技术纯化葫芦巴中葫芦巴总皂苷的工艺操作简单可靠 纯化率 高 刘长江等 26 超滤法分离鹿胎盘多肽的研究 研究了中空纤维超滤膜对鹿胎盘多肽中 小分子活性因子的截留 考察了压力 温度 流速 浓缩倍数及操作时间对分离效果的 影响 最终确定最佳工艺操作条件为操作压力为0 06MPa 温度为30 流速为 2 25mL s 浓缩倍数为2 倍 操作时间为3min 随着膜分离技术的成熟 现在越来越 多的应用于植物活性成分的分离 其中膜分离法已经应用于香菇多糖等的分离提取中 1 3 4 6 柱层析 多柱层析较为常用 需要手动装填层析柱 平衡 加样 逐管检测各管组分 可分 为两类 一般凝胶柱层析和离子交换层析 1 一般凝胶柱层析 27 凝胶层析也称为排阻层析 凝胶过滤 分子筛层析和凝胶渗透层析 它是 60 年代发 展起来的 该方法可根据多糖分子的大小和形状不同进行分离 以不同浓度的盐溶液和 缓冲溶液作为展开剂 离子强度最好不低于 0 02 从而使不同大小的多糖分子得到分离 纯化 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质 酶 多肽 激素 多糖 核酸类等物质 分 东北林业大学毕业论文 6 子大小彼此相差 25 的样品 只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开 利用凝胶的分 子筛特性 可对这些物质的溶液进行脱盐 浓缩 去热源和脱色 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质 不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶 它 们的内部都具有很细微的多孔网状结构 凝胶层析的机理是分子筛效应 如同过筛那样 不同交联度的凝胶具有不同孔径 而不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速 度不同 因此达到分离纯化的目的 凝胶颗粒在合适溶剂中浸泡 充分吸液膨胀 然后 装入层析柱内 加入欲分离的混合物后 在以同一溶剂洗脱 在洗脱过程中 大分子不 能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外 而小分子可以进入凝胶颗粒内部 的多孔网状结构 流速缓慢 以致最后流出柱外 从而使样品中分子大小不同的物质得 到分离 常用的凝胶有葡聚糖凝胶 SepHadex 琼脂糖凝胶 SepHarose 以不同浓度的盐 溶液和缓冲溶液作为洗脱剂 从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化 葡聚糖凝胶常 用 G X 代表 X 数字既代表交联度 也代表持水量 X 数字越小 交联度越大 网孔越小 吸水膨胀就越小 适用于分离低分子质量生化产品 相反 X 数字越大 交联度越小 该 方法的特点是 凝胶层析操作简便 所需设备简单 分离介质凝胶完全不需要像离子交 换剂那样复杂的再生过程便可重复使用 分离效果较好 重复性高 最突出的是样品回 收率高 接近 100 分离条件温和 分离的分子量范围也很宽 这种方法不适用于粘多 糖的分离 董宏坡等 28 应用柱层析从坛紫菜中纯化出别藻蓝蛋白的研究发现 采用30 35 饱 和硫酸铵沉淀 Tris HCl pH 8 0 作为洗脱缓冲液 DEAE SepHadex A 50作为层析介质 所获得的别藻蓝蛋白的纯度和回收率分别为3 50和70 2 SDS PAGE表明别藻蓝蛋白有 和 两个亚基 分子量分别为18 9 kD和17 7 kD 2 离子交换层析 29 离子交换层析 是在具有离子交换性能的物质作固定相 液体为流动相的系统中进 行的 如带负电荷的多糖可在阴离子 DEAE 纤维素 二乙基氨基乙基纤维素 柱或 DEAE SepHadex 柱上达到分级 酸性多糖可在阳离子型的羧甲基 CM SepHadex 等凝胶柱上分 离 洗脱剂可采用不同浓度碱溶液 硼砂溶液以及盐溶液 此法优点是可吸附杂质 纯 化多糖 并适用于分离各种酸性 中性多糖和粘多糖 由于酸性多糖常含有糖醛酸和各 种硫酸基 在溶液中以聚阴离子形式存在 因而适用此法 多糖在交换柱上的吸附力与 多糖结构有关 一般随酸性基团的增加而增加 对于线状分子 分子量较大的多糖吸附 力强 直链多糖较分支多糖易吸附 虽然不同食用菌多糖分离纯化的具体方法有所差异 但它们的基本步骤却是相似的 如预处理 主要去除脂类 提取 真空浓缩 醇沉 除蛋白 有机溶剂洗涤 乙醇 丙 酮 乙醚 柱或膜进一步分离 冷冻干燥等 1 4 多糖及其功能性质 1 4 1 多糖的概念及来源 多糖又称多聚糖 Pulysacchde 它是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物 通常多糖中的单糖分子都在一百个以上 多的可高达数千个 其性质与单糖 低聚糖相 比己经发生了很大的变化 如不溶于水 甜味和还原性消失等 其分子量一般为数万甚至 达数百万 是一类天然高分子化合物 是构成生命的四大基本物质之一 多糖不仅是构 成生命有机体的重要组分 而且在控制细胞分裂 调节细胞生长以及维持生命有机体正 常代谢等方面具有重要作用 某些不溶性多糖 如植物的纤维素和动物的几丁质 即壳多 糖 是构成植物细胞壁和动物外壳的组分 淀粉和糖原等则是储存形式的多糖 当生物体 东北林业大学毕业论文 7 需要时可被分解 释放出单糖 还有许多多糖 具有调节人体免疫力 抗肿瘤和抗放射等 复杂的生理功能 被称为功能多糖或活性多糖 发现最早的功能多糖 是从细菌中得到 的荚膜多糖 它在医药上主要用于疫苗 随着对这类多糖研究的不断深入 人们在人和 动物的多种组织 分泌液及某些植物 微生物中也发现了功能多糖的存在 其中研究比 较多和比较清楚的主要是来自各种植物多糖 例如 人参多糖 刺五加多糖 当归多糖 构祀多糖 黄茂多糖和黄精多糖等 来自食药用真菌的多糖 例如 香菇多糖 银耳多糖 灵芝多糖 云芝多糖 获荃多糖 猴头菇多糖和冬虫夏草多糖等 植物活性多糖植物活 性多糖的来源广泛 不同种的植物 活性多糖的结构 分子构成及分子量各不相同 生 物活性也不同 植物多糖虽种类繁多 但都是由许多相同或不同的单糖以 a 或 糖苷键 所组成的化合物 我国是中药的起源之地 而糖类是中药材中普遍存在的成分 在对各 种中药材的化学成分研究的过程中 人们都少不了对其中多糖的关注 植物活性多糖的 主要科属分布有五加科的人参多糖 刺五加多糖 豆科的黄蔑多糖 茄科的构祀多糖 鼠李 科枣仁内多糖 桔梗科的党参多糖等 此类活性多糖具有补中益气 养血生津的功效 而 且具有增强巨噬细胞的吞噬功能 促进体内淋巴细胞的转化 在体内不仅可以提高常规 淋巴因子激活杀伤细胞 LAK 的活性 而且可提 高快速 LAK 的活性 对 T B 细胞的功能 均有促进作用 并能增强免疫监视能力 减轻抗肿瘤化疗药物对免疫功能的影响 1 4 2 真菌活性多糖 真菌活性多糖是从真菌子实体 菌丝体 发酵液中分离出的 能够控制细胞分裂 分 乞 调节细胞生长 衰老的一类活性多糖 有关真菌多糖的研究既深又广 如酵母菌多 糖 犷用菌多糖 特别是食用菌多糖的研究 报道的频率是相当的高 其中以香菇多糖 研究的比较清楚 它们均含有某一特有的保守结构序列 且此结构不属于高等生物体的 正常组分 三类多糖具有免疫调节的功能 可能是由于高等动物非特异防御系统逐渐进 化 从而识别二些微生物的保守结构 30 与动 植物多糖不同的是 真菌多糖分子单体 主要以 1 3 与 1 6 糖苷键结合 形成链状分子 具有螺旋状的立体构型 且具 有四级万构 这一点与蛋白质结构类似 真菌多糖按单糖成分组成种类可以分为杂多糖 和均多糖 真菌多糖在免疫功能的调节 癌症的诊断与治疗 抗衰老及解除机体疲劳等 方面都有着重要的作用 且得到大量国内外科学实验结果证实 31 日本及欧美等国在真 菌多糖的研究方面始于 20 世纪 30 年代 积累了大量的科研资料 随着科研人员对真菌 多糖疗效的更深层次了解 真菌多糖势必将被应用于更多领域 尤其是制药及保健品行 业 1 4 3 活性多糖的生理功能 多糖的药理作用广泛 参与人体细胞的各种生命过程及生理功能的调节 并以独特 的活性和低毒性的特点使其在临床应用中具有很大的潜力 近几年来 大量药理及临床 研究证实 多糖有调节免疫 抗癌 抗病毒 抗衰老 抗肥胖 控制血糖 降胆固醇 降血脂等生理功能 是健康食品及营养保健食品的添加剂 多糖类药物研究正由一般药 理学向作用机理深入 由细胞水平向分子水平 基因水平深入 由单独用药向联合用药 与 细胞因子 放疗 化疗联合用药 以及结构修饰和新剂型等方面深入 调节免疫功能从细 菌 真菌 酵母 地衣和高等植物 海洋植物中提取的多糖均对免疫系统有重要的调节 作用 多糖作为一种免疫增强剂 不仅能激活巨噬细胞 MU T 淋巴细胞 B 淋巴细胞 自然杀伤细胞伽 K 细胞毒 T 细胞 CTL 淋巴因子激活的杀伤细胞 LAK 等免疫细胞的 活性 激活网状内皮系统 REs 吞噬 清除老化细胞和异物以及病原体的作用 还能促进 东北林业大学毕业论文 8 细胞因子生成 活化补体 从而在抗肿瘤 抗病毒以及抗衰老等的防治上具有独特的功 效 作为免疫调节剂 刺五加多糖可促进淋巴细胞增殖 使之代谢活跃 功能增强 以 此形态学改变为基础 促进了机体的免疫功能 1 4 3 1 多糖增强免疫功能 现已证实 很多多糖具有增强机体免疫的功能 如香菇多糖即是一种很好的免疫促 进剂 具有高度特异性免疫增强功能 在带癌情况下 一方面 它能活性腹腔巨噬细胞 的杀伤还原能力 另一方面 能恢复己降低的免疫功能 特别是能恢复 T 一协助细胞的 活性 同时 近百倍的提高抗胸腺依赖性抗原的体液性抗体 灵芝子实体多糖能增强小 鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力 诱导细胞色素 P 450 的形成 有利于增强机体的防御功能 提高机体保持稳态的能力 银耳多糖能促进淋巴细胞的转化 增强小鼠腹腔巨噬细胞的 吞噬功能 明显促进肝脏蛋白质核酸合成 促进骨髓造血功能 提高体液免疫力 黑木 耳多糖可有效的提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数和吞噬百分率 猪答菌核中的一种水溶性 多糖能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力 促进抗体形成 是一种良好的免疫调节 剂 1 4 3 2 多糖降血糖功能 Kouno等 32 从人参中提得的五种多糖 Panaxan A B C D E给正常小鼠注射 可 产生随剂量加大而增强的降血糖作用 其中主要的PanaxanA和B也可使糖尿病小鼠血糖下 降 刺五加具有降糖作用 同时具有降血脂 改善氧自由基代谢紊乱的药理活性 有助 于糖尿病并发症的防治 1 4 3 3 免疫调节和抗肿瘤作用 这是大多数活性多糖的共同特性 也是它们发挥其他生理和药理作用 如抗肿瘤 的 基础 许多多糖都是哺乳动物的免疫调节剂 33 真菌多糖作为一类免疫增强剂 他们的 抗肿瘤作用源与其免疫增强功能 34 研究认为多糖的抗肿瘤作用表现在两个方面口 14 一是表现为对肿瘤发生的预防 二是对已产生的肿瘤细胞的杀伤作用 多糖在这两方面 的作用是很显著的 这也是多糖能够得到广泛应用的重要原因 1 4 3 4 抗肿瘤试验 近几十年来 人们做了很多关于多糖抗肿瘤的试验 这些实验有体内的也有体外的 体内试验大部分是在各种动物 大小鼠 兔等 身上进行 所使用的瘤株也多集中在常用 的几个试验瘤株上 如实体瘤s 180 S 37 艾氏腹水瘤 宫颈癌U14 人白血病K582等 香菇多糖 松口菇多糖和羊脾RNA注入荷瘤小鼠内 不仅增强免疫活性 同时使脾 瘤等 组织的cAMP增高 且该增高与抑瘤率成正相关 可以说 真菌多糖既可以作预防肿瘤的 保健食品 也可以在肿瘤发生以后作为治疗肿瘤的辅助药物 1 4 3 5 抗病毒活性 研究表明 许多多糖对各种病毒有抑制作用 如艾滋病毒 Hlv l 单纯疤疹病毒 巨细胞病毒 流感病毒 囊状胃炎病毒 劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒 35 多糖的抗病毒 作用现已引起医药界的高度重视 尤其是硫酸多糖的强抗病毒活性 显示了多糖广阔的 药用前景 多糖在抗病毒药的研究中也常常作为佐剂 许多研究结果发现 多糖与其他 药物联用具有协同作用 将多糖作为佐剂联合用药可以防止或推迟耐药株的出现 提高 药物的抗病毒活性 减少用药量 例如硫酸右旋糖苷与叠氮胸昔具有协同作用 可以减 少用药量 降低不良反应 提高患者的耐受性 1 4 3 6 抗衰老活性 如螺旋藻多糖 PSP 是从螺旋藻中分离纯化获得的平均分子量为16 6kDa的酸性多糖 对D 半乳糖所导致的衰老小鼠模型有如下作用 抗小鼠肝 脑组织单胺氧化酶 MAO B 的 东北林业大学毕业论文 9 活性明显提高 抗Na K ATP酶活性降低 对抗小鼠淋巴细胞增殖转化降低的效应 拮抗 小鼠皮肤细胞中轻脯氨酸含量降低 从而防止胶原蛋白多肤链之间交联度的增加 代谢 率降低 防止皮肤组织弹性降低 此外多糖还具有抗氧化 17 降血糖降血脂 38 41 抗炎症 39 抑制细菌 40 等多种活 性 1 5 植物多糖的开发利用 随着分子生物学和细胞生物学的发展 多糖及其缀合物作为支持组织和能量来源的 传统观念早已被突破 而被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子 而 且由于它们常是细胞表面信号识别 抗原抗体反应 细胞间信息的传递和感受的关键因 子 因此 具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重视 随着研究的深入 越来越多的发现植物多糖具有很多特殊的功能 如药用功能 研 究表明 黄芪多糖 34 为易溶于水的白色粉末 它对免疫抑制剂造成的免疫低下有明显的 保护作用 是具有双向作用的免疫调节剂 因而对临床肿瘤放疗患者 慢性放射患者及 各种原因造成免疫功能低下患者是一种很有效的辅助治疗药 同时具有双向调节血糖作 用 21世纪人们更希望吃的健康 所以有很多多糖应用于食品领域 如爱玉多糖用于浓 缩果汁 提高果汁的稠度和稳定性等 还有些多糖应用于面制品 肉制品 冰激凌 果 冻中等等 1 6 论文研究内容和意义 黄伞 PHoliota adipose Fr ouel 是一种生长于柳树上的大型真菌 黄伞子实体进 行营养成分分析 发现黄伞子实体中粗蛋白质 粗纤维和灰分的含量与 食物成分表 中一般食用菌的含量相当 粗脂肪含量低于一般食用菌 多糖含量为 4 11 高于一般 食用菌 营养价值极高 目前已确定黄伞多糖具有抗肿瘤 抗疲劳 抗微生物活性等生 物功能 因此引起了人们越来越多的关注 黄伞营养保健价值高 但国内对黄伞的研究起步较晚 且主要停留在对黄伞的野生 驯化 生物学特性及人工栽培技术等方面 42 44 目前关于黄伞子实体纯化多糖的研究很 少 本文以小鼠免疫力的提高功能来确定黄伞子实体多糖的生物活性 对进一步研究黄 伞多糖的生物功能具有重要的意义 我国菌物资源丰富 但食用菌资源大都处于野生状态 并没有得到有效的利用与开 发 食用菌保健品种类比较单一 主要以饮料 冲剂 胶囊和保健酒为主 而研究表明 食用菌具有的生物活性 可以提高人体的免疫力 抗衰老 抗癌 特别是野生食用菌功 效更显著 因此 驯化野生食用菌 开发食用菌新产品 具有深远的意义 1 7 主要研究内容 1 研究黄伞子实体粗多糖的初步纯化 实验部分采用水提醇沉法 采用料液比 1 20 提取时间 2h 提取温度 90 的提取条件 提取次数 2 次 合并两次的提取液的 提取条件 粗多糖经 Sevag 中性蛋白酶 法除去蛋白质 并比较两种方法除蛋白的效率 2 研究黄伞子实体多糖的免疫活性 试验中采用动物实验的方法 小鼠分 1 2 批 免疫 1 批进行脏体比测定 迟发型超敏反应 血清溶血素的测定 免疫 2 批进行小鼠碳 廓清试验 东北林业大学毕业论文 10 2 材料与方法 2 1 试验材料 2 1 1 试验原料 黄伞 PHolita adiposa 东北林业大学森林保护实验室从野外分离得到 2 1 2 试剂试剂 印度墨水 北京市西中化工厂 注射用环磷酰胺 山西普德药业有限公司 绵羊红细胞 SRBC 哈尔滨润博生物科技公司 中性蛋白酶 北京奥博星生物技术有限责任公司 无水乙醇 苯酚 正丁醇 乙醚 氯仿 硫酸 丙酮 葡萄糖等以上均为分析纯试 剂 水提法提取的黄伞多糖 灰白色粉状固体 配成高中低三个浓度的多糖溶液 即 100mg kg 200 mg kg 400 mg kg 置于 4 条件下储存 2 1 3 试验主要仪器 可见光分光光度计 722 PC 上海精密科学仪器有限公司 紫外可见分光光度计 765 PC 上海精密科学仪器有限公司 循环水多用真空泵 SHB 3 郑州杜甫仪器厂 台式低速大容量离心机 TDL 40B W 湖南星科科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅 DK S12 上海森信实验仪器有限公司 电子精密天平 JA2003 上海良平仪器仪表有限公司 分析天平 ALC 1104 北京赛多利藏拙仪器系统有限公司 鼓风干燥箱 DHG 9240 上海恒科学仪器有限公司 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特仪器有限公司 真空泠冻干燥机 CHRIST 1 2 德国 Christ 公司 台式离心机 TDL 5 上海安亭科学仪器厂 微量血凝试验板 96 孔 东北林业大学毕业论文 11 游标卡尺 精密度 0 02mm 哈尔滨量具刃具厂 微量注射器 1mL 血色素吸管 20 L 计时器 灌胃针 恒温 CO2 培养箱 HF151 Heal Force Development Ltd 漩涡混合机 XW 80A 江苏海南市其林贝尔仪器制造有限公司 2 2 试验方法 2 2 1 黄伞子实体多糖的提取 黄伞子实体经粉碎过 60 目筛 醇沉过夜除去小分子多糖 以料液比 1 20 提取时 间 2h 提取温度 90 的条件 45 得到多糖提取液 残渣在上述条件下复提 得到二次提 取液 合并两次提取液 在 60 旋转蒸发至原体积的 1 4 浓缩后冷却至室温 加入 3 倍体积的 90 乙醇 醇沉过夜 于 4000r min 条件下离心 10min 弃去上清液 沉淀物经 冻干得黄伞粗多糖 2 2 2 黄伞子实体粗多糖的初步纯化 2 2 2 1 Sevag 法 在 60 旋转蒸发至原体积的 1 4 浓缩后冷至室温 加入 3 倍体积的 90 乙醇 醇沉 过夜 于 4000r min 条件下离心 10min 弃去上清液 冷至室温 按 Sevag 法 氯仿 正 丁醇 4 1 除去游离蛋白质 醇沉过夜 离心 沉淀经有机溶剂洗涤 洗涤的顺序为 丙酮 乙醚 无水乙醇 冻干得黄伞子实体多糖 2 1 2 2 中性蛋白酶 Sevag 在 60 旋转蒸发至原体积的 1 4 浓缩后冷至室温 加入 3 倍体积的 90 乙醇 醇沉 过夜 于 4000r min 条件下离心 10min 弃去上清液 按 2 加入中性蛋白酶 45 最佳温 度为 50 时间 2h PH 7 0 2h 后升温至 80 灭酶 10min 其余同 2 2 2 1 2 2 3 多糖含量的测定 苯酚 硫酸法因方法简单 快速 无需多糖纯品等优点被广泛应用于多糖含量的测 定 因此本实验采用此法 得回归方程 Y aX b 多糖提取得率计算公式 多糖提取得率 85 9993 W CDV C a b OD490 其中 C 为供试液浓度 g mL D 为供试液的稀释倍数 V 为浸提液体积 mL W 为供试品干重 g 东北林业大学毕业论文 12 85 9993 为黄伞回流之后的平均