2006364116模拟酸雨对一年生黑麦草生长及抗氧化能力的影响20101015160647.doc

本科生毕业论文题 目:模拟酸雨对一年生黑麦草生长及抗氧化能力的影响 姓 名: 李人杰 学 院: 生命科学学院 专 业: 生物技术 班 级: 班 学 号: 2006364116 指导教师: 刘爱荣 职称: 教授 2010年5月29日安徽科技学院教务处制目 录摘要2关键词2引言21 材料与方法21.1 材料 21.1.1供试材料 21.1.2模拟酸雨的配制 21.1.3药品 21.1.4仪器 31.2方法 31.2.1试验设计 31.2.2根系活力、叶绿素含量和硝态氮含量的测定 31.2.3抗氧化酶活性的测定 41.2.4丙二醛含量和质膜透性的测定42 结果与分析 42.1模拟酸雨对根系活力的影响 42.2模拟酸雨对黑麦草叶片叶绿素含量的影响 52.3模拟酸雨对硝态氮含量的影响 52.4叶片CAT活性变化62.5叶片POD活性变化62.6叶片SOD活性变化72.7模拟酸雨对叶片MDA含量的影响 72.8模拟酸雨对叶片细胞质膜透性的影响83讨论 8致谢9参考文献9英文摘要10英文关键词10模拟酸雨对一年生黑麦草生长及抗氧化能力的影响 生物技术专业学生 李人杰指导教师 刘爱荣摘要：以一年生黑麦草为试验材料，在pH值为5.6、5.0、4.0、3.0、2.0的模拟酸雨处理下，研究了其若干生理指标及叶片抗氧化系统的变化。结果表明，随着模拟酸雨pH 值的下降，一年生黑麦草根系活力、超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化氢酶(CAT) 的活性呈先上升后下降趋势；叶绿素含量呈下降趋势；硝态氮含量、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量和质膜透性(PMP)呈上升趋势。pH值为5.0、4.0、3.0、2.0的模拟酸雨对一年生黑麦草均有伤害，pH值为5.6的模拟酸雨对一年生黑麦草的影响较小。关键词：生理指标；酸雨；一年生黑麦草酸雨是指大气中的SO2、SO3和氮化物与雨、雪等作用形成H2SO4和HNO3等含酸成分的降雨降雪等，国际规定酸雨为pH5.6 的降水1。自20世纪70年代以来，酸雨已逐步成为世界性的公害。先是在欧洲、北美相继出现大范围的酸雨。80年代中期以后， 我国的酸雨区域也日益扩大，从西南、华南逐步向北推移，酸雨中心地区雨水pH也越来越低2-3，酸雨已成为目前世界生态环境主要问题之一，也是我国的重大环境问题4。20 世纪60年代，国内外学者就酸雨对植物生长的影响做了大量的研究，酸雨可使植物叶片失绿、枯落、生长减缓、生物量下降。原因是酸雨打破植物体内活性氧代谢系统的平衡、破坏和降低活性氧清除酶系（SOD、CAT、POD）与淬灭剂（AsA、VE、Pro、GSH）的活性及含量，导致活性氧生成量增加，过量的自由基会造成细胞质膜选择透性的改变或丧失，电解质渗透增强，细胞电化学平衡破坏，代谢紊乱，细胞死亡5-7。一年生黑麦草作为一种重要的牧草，对畜牧业的发展有十分重要的作用8，但酸雨对黑麦生长及抗氧化能力的影响鲜见报道。本试验探讨了模拟酸雨对一年生黑麦草若干生理指标的影响，以期为防治酸雨对一年生黑麦草的危害提供一定的依据。1 材料与方法 11 材料111供试材料: 一年生黑麦草种子由山东农业大学草坪研究所提供。112模拟酸雨的配制用化学纯浓硫酸和浓硝酸按硫酸根与硝酸根的摩尔比为51 配成混合酸母液，再用自来水稀释，用精密酸度计配成pH分别为5.6、5.0、4.0、3.0、2.0的模拟酸雨，并以不加酸的自来水作为对照（CK）pH为7.2。113药品硫酸分析纯上海振企化学试剂有限公司无水乙醇分析纯上海振企化学试剂有限公司丙酮分析纯合肥工业大学化学试剂厂水合三酮氢茚（茚三酮）分析纯上海展云化工有限公司硝酸钾分析纯上海化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯上海化学试剂有限公司甲苯分析纯蚌埠化学试剂厂85磷酸分析纯国药集团化学仪器有限公司硫基水杨酸分析纯国药集团化学仪器有限公司正丙醇分析纯国药集团化学仪器有限公司正丁醇分析纯上海化学试剂有限公司乙二醇化学纯上海仪器三厂114仪器722S型可见光分光光度计上海陵光技术有限公司DDS-307型电导率仪上海精密科学仪器有限公司FA1004N型分析天平上海精密科学仪器有限公司电子万用炉天津市泰斯特仪器有限公司HH-S型恒温水浴锅江苏金坛国胜实验仪器厂JY2001型电子天平上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂TDL-60B型台式离心机上海安亭科学仪器厂SHB-B95型循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司12 方法1.试验设计2010年3月2日将黑麦草种子用0. 1 %的HgCl2消毒10 min，用自来水冲净，浸种24 h，将黑麦草种子均匀播在垫有2层吸水纸的白瓷盘(长15 cm、宽10 cm)中，置于25/18(昼/ 夜)恒温箱中发芽，白瓷盘中的吸水纸保持湿润，2010年3月23日移至西区温室中并浇灌1/ 2 浓度Hoagland营养液，2010年4月2日挑选长势一样的小苗，移栽至内装有完全Hoagland营养液的塑料桶(直径17 cm、高15 cm)中，共30桶，每桶50株苗，培养过程中无天然降雨的影响，其中每4天更换一次营养液，每天补充蒸发的水分至预定体积。于2010年4月20日第一次开始处理，并设置6个处理组，5个重复。试验期间每天处理一次，共14次，处理时间为每天下午。每个试验组用微型喷雾器向受试材料叶面喷洒模拟酸雨1500 mL，对照植株喷等量自来水，每次持续30 min。10 d后开始各项指标的测定。1. 2. 2 根系活力、叶绿素含量和硝态氮含量的测定用氯化三苯四氮唑（TTC）法测定根系活力，用722S型可见光分光光度计测吸光度求出四氮唑还原量9。以此表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。叶绿素含量测定：每种处理取叶片约0.3g左右，放在研钵中加碳酸钙、石英砂及80%丙酮研磨至匀浆，将匀浆过滤到25mL棕色容量瓶中，用80%丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗进行过滤。用80%丙酮冲洗滤纸，直至无绿色为止，最后用80%丙酮定容至25mL，摇匀。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，用722S型可见光分光光度计测出OD663和OD645，根据公式CT=20.29A645+8.05A663计算出提取液中叶绿素的含量9。浓酸条件下NO与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，再加入8%的NaOH溶液，在410nm波长下测其吸光度。在标准曲线上查出硝态氮浓度，计算样品中硝态氮的含量9。1. 2. 3 抗氧化酶活性的测定取0. 5 g根和叶加入p H值7. 8的磷酸缓冲液( PBS) 冰浴研磨，定容至5 mL，10000 r/ min、4 下离心20min，取上清液。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定用氮蓝四唑(NBT)法，以每g鲜重抑制NBT光化还原50 %作为1个酶活性单位9。过氧化物酶( POD)活性的测定用愈创木酚法，在测定条件下以1 min内OD470变化值表示酶活性大小，以每分钟OD470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位(U)9。过氧化氢酶(CAT) 活性测定用紫外吸收法 ，以每分钟OD240减少0.1的酶量为一个酶活性单位(U)9。1. 2. 4 丙二醛含量和质膜透性的测定丙二醛含量测定(MDA)：称取剪碎的新鲜叶片，每种处理三份，共0.5g，加5%三氯乙酸（TCA）5mL，研磨后，所得匀浆在3000r/min下离心10min。取上清液3mL，加0.67%的硫代巴比妥酸（TBA）3mL，混合后在100水浴上煮沸30min，冷却后，再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值9。细胞质膜透性的测定：相对电导率的测定按照李振国和谭常方法进行10-11。取材料2g，在45萎蔫1h，加20mL蒸馏水后抽气，DDS-307型电导率仪直读电导仪测定电导率(C1)，再将样品在沸水浴中直至发黄，冷却，再测定其电导率(C2)，质膜透性用相对电导率表示:相对电导率=(C1/C2)100%，每处理重复3次，结果取其平均值。2 结果与分析2.1模拟酸雨对根系活力的影响图1模拟酸雨对一年生黑麦草根系活力的影响Fig. 1 Effect of simulated acid rain on root activity of Lolium multif lorum 由图可知，随着模拟酸雨pH值的降低，其根系活力呈先上升后下降趋势。模拟酸雨pH值为5.6时根系活力明显上升，pH为5.0、4.0、3.0、2.0时根系活力分别为对照的92.45%、92.34%、83.83%、52.51%。2.2模拟酸雨对黑麦草叶片叶绿素含量的影响 图2酸雨对一年生黑麦草叶片叶绿素含量的影响Fig. 2 Effect of simulated acid rain on chlorophyll content of Lolium multif lorum leaves植物叶片衰老或逆境胁迫时，由于活性氧的累积会使叶绿素降解。从图2可以看出一年生黑麦草经模拟酸雨处理，随着pH值的下降，一年生黑麦草叶片的总叶绿素含量呈下降趋势。其中pH 值5.6 时与对照比差异不大，而pH值4.0时，降幅更明显。pH值为5.0、4.0、3.0、2.0时，叶绿素含量分别为对照组的81.39%、73.22%、69.61%、48.46%。2. 3模拟酸雨对硝态氮含量的影响由图2可知，pH5.6时硝态氮含量与对照相比略有下降，为对照的97.43%。pH5.0、4.0、3.0、2.0硝态氮含量迅速增加，分别较对照增加了18.22 %、22.90%、48.87%和51.69%。图3 模拟酸雨对硝态氮含量的影响Fig. 3 Effect of simulated acid rain on NO-N content of Lolium multif lorum24 叶片CAT活性变化图4模拟酸雨对一年生黑麦草叶片CAT活性的影响Fig.4 Effect of simulated acid rain on CAT activity of Lolium multif lorum leavesCAT 存在于过氧化物体内,可以清除自由基。从图4可以看出一年生黑麦草叶片的CAT 活性在不同浓度模拟酸雨的胁迫下,随着pH值的降低而呈先上升后下降趋势。其中pH 值5.6时,品种的CAT活性明显上升,可能这与它们在较轻的酸雨胁迫下抗性增强有关。pH值为5.0、4.0、3.0、2.0时，CAT活性分别为对照的94.89%、87.44%、85.18%、82.92%。25 叶片POD活性变化由图5可以看出,在模拟酸雨pH逐渐降低的情况下,一年生黑麦草的POD 活性有上升的趋势。且随着pH 值的下降,升幅明显。但pH为5.0时POD活性比5.6时略有下降，pH为3.0时POD活性比4.0时略有下降。pH5.0、4.0、3.0、2.0时，POD活性分别比对照增加了66.00%、43.94%、109.95%、106.70%、126.65%。POD活性的增加一方面有利于清除活性氧,另一方面POD对植物生长有调节作用,它参与细胞壁多种结构成分的聚合作用,使植物细胞失去伸展性,从而限制植物细胞伸长。因此POD 的上升会间接减少植物的生长量。图 5模拟酸雨对一年生黑麦草叶片POD 活性的影响Fig.5 Effect of simulated acid rain on POD activity of Lolium multif lorum leaves2. 6 叶片SOD活性变化植物在逆境下出现的伤害或植物对逆境的不同抵抗能力往往与体内SOD 活性水平有关。由图6可知,一年生黑麦草叶片的SOD 活性在不同浓度模拟酸雨的胁迫下,随pH 值降低而呈先上升后下降的趋势。在pH 值为5.6、5.0 时,SOD 活性略有上升,说明较轻的模拟酸雨胁迫可以激活一年生黑麦草的SOD 活性,以提高抵抗逆境胁迫的能力。在pH 值为4.0、3.0 、2.0时，SOD的活性分别为对照的98.15%、75.16%、68.53%。图6酸雨对一年生黑麦草叶片SOD 活性的影响Fig.6 Effect of simulated acid rain on SOD activity of Lolium multif lorum leaves27 模拟酸雨对叶片MDA 含量的影响植物衰老或在逆境胁迫下,活性氧代谢失调是引起细胞伤害的主要原因。MDA 是膜质过氧化过程的产物,反过来又会加剧膜的损伤。由图7可看出在酸雨胁迫下,一年生黑麦草叶片的MDA 相对含量随着模拟酸雨pH 值的降低而上升。模拟酸雨的pH值为5.6、5.0、4.0、3.0、2.0时，MDA的含量分别比对照增加了11.15%、12.55%、14.81%、23.61%、26.43%。图7模拟酸雨对一年生黑麦草叶片MDA 相对含量的影响Fig. 7 Effect of simulated acid rain on MDA content of Lolium multif lorum leaves28 模拟酸雨对叶片细胞质膜透性的影响 细胞质膜透性是反映植物遭受酸雨伤害的一个敏感指标。如图8所示，在模拟酸雨处理下，叶片的细胞质膜透性随pH值的降低而显著增大。但在pH值为5.6时质膜透性较对照有所降低，为对照的86.22%。模拟酸雨pH5.0、4.0、3.0、2.0时，细胞质膜透性分别比对照组上升了27.87% 、30.06% 、38.65%和41.33%。图8 模拟酸雨对叶片质膜透性的影响Fig.8 Effect of simulated acid rain on membrane permeability of Lolium multif lorum leaves3 讨论酸性沉降物(尤其是酸雨)已经成为全球性的环境问题。由于酸雨对生态环境的破坏不可能在短时间内得到恢复，加之未来20年内我国酸雨的影响将继续扩大并对工农业生产及人民生活产生严重的、持续的影响,因此在减少污染物排放量,控制酸雨前染物排放源的同时,探讨植物对酸雨的响应,以便采取有效的防治措施具有重要意义12。国内外学者研究发现酸雨能对植物造成明显的伤害，引起生理代谢紊乱，甚至死亡，不同种类植物对酸雨的反应敏感性表现不一13。模拟酸雨胁迫下,一年生黑麦叶片的SOD、CAT 活性呈先上升后下降趋势,而POD 活性上升,保护酶系统作用的结果是随着酸雨pH 值的下降,膜质过氧化加剧,MDA含量增加。膜质过氧化的加剧会导致膜脂不饱和度降低,导致细胞质膜断裂, 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫程度有关，也与植物抗逆性程度有关。且质膜透性增大,叶绿体受破坏,叶绿素降低。而POD 活性的增大,是一年生黑麦草在酸雨胁迫下,以降低生物量为代价,以适应逆境的一个表现。模拟酸雨胁迫下，硝态氮的含量呈上升趋势，硝态氮在植物体内需经硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的还原作用被还原成氨态氮，进而参与氨基酸的形成。在外部环境不适合植物体内硝态氮还原的条件下，植物体内的硝态氮会大量地积累。植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长，营养状况及产量水平，模拟酸雨胁迫下，根系活力呈下降趋势。随着模拟酸雨pH 值的降低,一年生黑麦草在pH 值2.0时,才表现明显的可见伤害斑,说明酸雨对一年生黑麦草生理指标的影响作用较叶片可见伤害更为敏感。 致谢感谢对本次试验给予耐心指导的刘爱荣老师！感谢对本次试验给予帮助的崔峰老师、康健老师、郑玉华老师和孙勤富同学！感谢参加评阅的老师给予指导！参考文献1 花日茂,李湘琼.我国酸雨的研究进展J,安徽农业大学学报:自然科学版,1998, 25(2):206-210.2 李宗恺,王体健,金龙山.中国的酸雨模拟及控制对策研究J.气象科学, 2000, 20(3): 339-347.3 吕忠才,高晖,黄继国.我国酸雨污染及其控制规划构想J.中国环境管理, 2001,(4): 7-10.4 石彦军,余树全,郑健,等.野生花卉地榆叶片对模拟酸雨的生理响应J.安徽农业科学,2009,37(21): 952-955.5 宋贺,黄婷,董召荣,等.酸雨胁迫条件下紫花苜蓿种子萌发和幼苗生理特性的变化J. 生物学杂志, 2007, 24(5): 40-43.6 周青,黄晓华,曾庆玲,等.植物酸致损伤机理与化控减灾研究进展J.农业环境科学学报,2003, 22(5): 632-635.7 Misako K, Shimizu S. 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