补体检测及应用PPT课件.ppt

第十九章 补体检测及应用 1 存在于人和脊椎动物血清或组织液 具有酶样活性 不耐热的糖蛋白由肝细胞 巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生均为多糖蛋白 可以辅助抗体发挥溶细胞作用补体不是单一成分 以 补体系统 存在在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时 含量及其活性可发生改变 因此对补体含量与活性进行检测 对相关疾病进行诊断 补体 complement C 2 第一节概述 一 补体成分的含量与理化特性 1 根据补体系统的生物学功能分类补体固有成分补体调节蛋白补体受体 complementreceptor CR 3 4 对热不稳定 56 30min即被灭活 0 10 条件下活性只能保持3 4d 多种理化因素如射线 机械振荡 酒精 胆汁和某些添加剂等均可破坏补体 2 补体的理化特性 5 二 补体的活化途径 P因子 6 7 三种途径比较 8 第二节补体总活性测定 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示 以50 溶血为判断终点 称为CH50 50 complementhemolysis 应用不同的激活物可活化不同的补体途径基于经典途径的CP CH50 临床常规项目 应用于C3旁路检测的AP CH50 尚未列入检验常规 9 1 CH50测定法的原理 10 在适当 稳定的反应系统中 溶血反应与补体的剂量依赖关系呈现 S 形曲线 补体的剂量 以引起50 溶血所需要的最小补体量为一个CH50U 可计算出待测血清中总的补体溶血活性 以CH50U ml表示 11 2 CH50测定方法 以2 5ml反应体系为例 2 绵羊红细胞 1 20稀释待检血清 稀释缓冲液 磷酸或巴比妥 2U溶血素 1 1 1 50ml 0 5ml 0 5ml 0 100 150 20 0 500 00 1 401 351 30 1 001 50 37 水浴箱中温育30min后2000r min离心10min 致敏红细胞 12 2 试验结果判断 50 溶血标准管 肉眼观察溶血程度与之最相近的两管 置于分光光度计 读取OD542值 最接近标准管OD值的一管 确定为补体最高反应管 3 50 溶血的总补体值的计算 CH50 U ml 1 待检血清用量 稀释倍数 注意 用CH50法测定总补体溶血活性时 所测的值与反应体积成反比例关系 一般以反应总体积2 5ml为常用 测得的总补体活性的参考范围为50 100U ml 13 举例 血清补体总活性测定 50 溶血标准管的OD542 1 6610 第4管为最高有效反应管 CH50 U ml 1 0 25 20 80 表明 待测血清50 溶血的总补体值为80 在2 5ml反应体系的总补体活性的参考范围50 100U ml内 14 3 方法评价与临床意义 方法简便 快速 但敏感性低 补体的活性除与反应体积成反比外 还与反应所用的缓冲液 SRBC的数量以及反应温度都有关 CH50增高见于 心肌梗死 甲状腺炎 大叶性肺炎 糖尿病 妊娠等CH50降低见于 严重肝病或不良时营养 细菌感染自身免疫病的诊断及动态检测 15 第二节补体组分的检测 常作为单个补体成分的检测指标 C3 C4 C1q B因子和C1酯酶抑制物等测定方法 活性测定 免疫溶血法含量测定 免疫化学法 自动化免疫散射比浊法 16 免疫溶血法 定义 是根据补体参与介导抗体溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法指示系统 以SRBC 抗SRBC为激活物和指示系统参照体系 以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照结果判度 若有溶血发生 表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分 且溶血程度与此补体成分的量呈正比 仍以50 溶血为终点 17 18 参照血清常称之 R remove 试剂 即去除某种补体成分之意 已能筛选到的血清有人C2缺乏 豚鼠C4缺乏 小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清免疫溶血法常用于C2 C3 C4 C5 C6等补体成分的检测 其中以C3 C4两成分的检测更为常见 19 第三节补体结合试验 补体结合试验 complementfixationtest CFT 是指在补体的参与下 以绵羊红细胞 SRBC 和溶血素 抗SRBC的抗体 作为指示系统的用已知抗原或抗体检测相应未知抗体或抗原 20 21 Ag Y Ab阳性 NoAb阴性 Ag Ag Ag 22 二 方法 1 2 3 4 5 试验管 血清对照管 抗原对照管 补体对照管 SRBC对照管 待测血清 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 4mL 0 8mL 抗原 补体 N S 摇匀 37 水浴15min 溶血素 SRBC 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 摇匀 37 水浴15min 23 预期结果 管内液体混浊呈浅红色为不溶血 管内液体透明呈红色为溶血 2 24 1 补体的滴定 1个实用单位 能产生完全溶血的最小补体量 正式试验中使用2个实用单位 三 技术要点 25 2 已知抗原或抗体的滴定 通过CFT试验 抗原和抗体效价的方阵滴定 1 64的抗原作为一个单位 1 32的抗体作为一个单位 2 4个单位 即1 32 1 16 4个单位 即1 8 正式试验 26 最好 采集血标本后及时分离血清并尽快检测保存 20 检测不同时采集的2份以上血清实验前灭活补体和某些非特异性反应因素 加热56 30min或60 3min 3 待测标本 27 四 方法评价 优点灵敏度高 所测定的抗体水平可达0 05 g ml 出现交叉反应的机率较小可检测的抗原或抗体范围广泛无需特殊设备 结果容易观察 试验条件要求不高现状影响的因素多 各种制剂需要烦琐的稀释和滴定等 现代化 自动化抗原抗体检测方法的不断涌现 补体结合试验逐渐被遗弃补体结合试验作为一种经典的免疫方法类型 其设计和原理仍对新型免疫方法的建立有着启迪和指导作用 28 复习题 1 已知补体的活化有三条途径 试述三条激活途径有何不同 2 补体结合试验的原理和方法 3 血清总补体容血活性 CH50 测定的原理及方法 4 免疫溶血法测定补体单个成分的原理 29 50 溶血标准管 2 绵羊红细胞0 50ml 蒸馏水2 0ml 第一步 第二步 第三步 1 80 NaCl溶液