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氯霉素测定技术 王舒峰 背景 2002年3月 泰国 越南 印尼 印度 孟加拉 77个样品中有16个含量超标我国出口荷兰 法国等欧盟国家的乳制品等已被销毁或退回 欧盟及北美等发达国家加强进口商品的检测 美国和加拿大不容许氯霉素用于最终为人类食用的动物身上 仅批准用于宠养动物疾病的治疗 如猫 狗和马欧盟的96 23 EEC 指令中把氯霉素列入禁用药 氯霉素类药物是A类禁用药日本规定所有最终为人类所食用的动物源性食品中氯霉素残留的容许量必须为零 氯霉素分析 氯霉素类 别名左霉素 氯胺苯醇 化学结构毒理学药物 代谢 动力学兽医上禁止使用代谢物化学结构测定方法提取和净化分析 GC MS MS等 氯霉素的化学结构 化学名 2 2 二氯 N 2 羟基 1 羟甲基 2 4 硝基苯基 乙基 乙酰胺CAS编码56 75 7 分子式 C11H12O5N2Cl2分子量 323 14 药理作用和用途 CAP是第一个广谱抗生素药 有广谱抑菌作用 对革兰氏阳性 阴性菌均有抑制作用 尤其对伤寒 副伤寒杆菌作用更强 其次为大肠杆菌 变形杆菌 痢疾杆菌 流感杆菌和百日咳杆菌等 广泛用于临床医学及兽医方面的细菌性感染疾病的控制和治疗 应用至今已有40年的历史 氯霉素的抗菌作用通过在生物体内将硝基还原成亚硝基 而后亚硝基不可逆地同线粒体细胞结合 抑制了细菌细胞壁形成所必需的蛋白质的合成 苯环对位上的硝基可增强这类 苯醇类 物质的抗菌作用 作为兽药 CAP最常被作为兽医用的治疗和预防用药 经口服后很快就被吸收 低计量时 CAP表现为抑菌作用 杀菌活性出线在较高剂量时 用法及用量 混饲 每1000公斤饲料 鸡预防用100 300克 治疗用500 1000克 混饮 每升水 鸡预防用100 300毫克 治疗用500毫克 内服 一次量 每公斤体重 犊牛 狗 猫10 20毫克 每日二次 静脉 肌肉或皮下注射 一次量 每公斤体重 禽20 50毫克 猪 羊10 20毫克 狗 猫20毫克 每日二次 毒理学 氯霉素主要毒性反应是抑制骨髓造血机能 可引起粒细胞及血小板减少及再生障碍性贫血 口服有恶心 厌食 腹胀 腹泻等胃肠道反应 目前一些国家和地区 还把氯霉素作为一种畜用饲料添加剂和动物疾病的治疗用药 这样必然会造成动物肌肉 内脏和乳汁中的残留 直接或间接威胁人类的健康 为此世界各国纷纷在临床上已严格控制使用 药物 代谢 动力学 通过用同位素示踪的的方法研究 发现CAP排泄的主要途经是 粪便 64 3 尿 16 0 代谢 除了未经变化的CAP 有CAP 葡糖苷酸 CAP 碱 CAP 乙醇 CAP 草氨酸 CAP 乙酰芳基胺等 氯霉素 高稳定性较长的残留时间当母体化合物残留量降到检测线以下 其与蛋白质结合的代谢物仍然能检测到 氯霉素测定技术 1 HPLC法a 色谱柱 通常用C18柱或C8柱 b 流动相 通常用甲醇 水 0 01M乙酸钠缓冲液 PH4 3 乙腈 c UV测定波长 有280 278 270和285nm等 HPLC法测定低限较差 一般在10ppb 氯霉素测定技术 2 HPLC MS法HPLC条件如上 费用昂贵 HPLC MS MS检测 测定低限一般在0 1ppb 氯霉素测定技术 3 GC法GC法包括GC ECD法和GC MS法 在用GC法测定时 要将CAP衍生化 由于硅烷化条件不同 可生成不同的产物 为了提高硅烷化程度 一般用 BSTFA99 1 TMS 氯霉素测定技术 4 ELISA法 酶联免疫法 国外已有商品试剂合供应市场 只限于样品筛选 氯霉素检测特点 沸点高极性强质谱的背景噪音高 衍生化的作用 在GC MS方法分析样品时 对羟基 胺基 羧基等官能团进行衍生化有十分重要的作用 主要表现在 改善样品的气相色谱性质 如羟基 羧基等气相色谱特性不好 改善样品的热稳定性 改善样品的分子质量 分子量增大 有利于样品与基质的分离 改善样品的质谱行为 引入卤素或吸电子基团 是样品可用CI检测 提高灵敏度 分离手性化合物 GC MS方法中常用的衍生化方法 硅烷化 silylation 酰化 acylation 烷基化 alkylation 判断衍生化反应的指标 反应是否迅速 定量进行 反应重复性好坏 反应条件是否温和 是否容易操作 反应选择性高 最好只于目标化合物反应 衍生化产物只有一种 反应的副产物和过量的衍生化试剂应不干扰目标化合物的分离和检测 衍生化试剂通用性好 价廉易得 衍生化方法应用不当的弊端 柱上衍生化可能损伤色谱柱 某些衍生化试剂需氮气吹干 衍生化不完全 影响灵敏度 衍生化试剂不当 产物分子量过大 总之 GC MS检测中选用衍生化试剂时 除了和气相色谱法相同的准则外 还应注意衍生物的质谱特性 质量碎片特征性强 分子量适中 适合质量型检测器检测 有利于与基质干扰物的分离 硅烷化衍生化方法是气相色谱样品处理中应用最多的方法 它是利用质子性化合物 如醇 酚 酸 胺 硫醇等 与硅烷化试剂反应 形成挥发性的硅烷化衍生物 常用的硅烷化试剂 硅烷化试剂中的烷基硅烷基和反应物中的羟基或胺基上的氢发生交换 形成烷基硅烷基产物 常用的硅烷化试剂有 N O 双三甲基硅基三氟乙酰胺 BSTFA 和N O 双三甲基硅基乙酰胺 BTA 能衍生化胺基和羟基 常用于体内药物及其代谢物的检测 N 甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺 MTBSTFA 常用于药物 类固醇的检测 由于叔丁基二甲基硅基有较大的空间效应 有些胺基较难衍生化 在质谱检测中 该衍生物很容易失去叔丁基形成较强的 M 57 离子 有利于作为MS MS的母离子 N 甲基三甲基硅基三氟乙酰胺 MSTFA 最常用的硅烷化试剂之一 衍生化也是引入三甲基硅基 硅烷化的技术要点 常用的硅烷化试剂的一般衍生化条件 在吹干的提取物残渣中加入100 l的MSTFA或BSTFA 加入50 l的吡啶或乙腈 或用事先配好的衍生化试剂中加催化剂 三甲基碘硅烷TMSI或三甲基氯硅烷TMSCI 和抗氧剂 硫代赤藓糖醇 衍生化小瓶加盖后在60oC衍生化5 30min 或微波衍生化2 3min 视不同化合物而定 残渣吹干水分对衍生化十分关键 因为衍生化试剂MSTFA和BSTFA遇水立即分解 衍生化 氯霉素衍生物 技术发展趋势 1 开发高灵敏的检测方法的研究 降低测定检测限 2 利用新的如 GC NCI GC MS MS HPLC MS HPLC MS MS技术提高定性能力 3 建立快速 灵敏的筛选方法 ELISA试剂合的开发 4 建立适用于不同机体的灵敏度高 定性能力强的测定方法 氯霉素衍生物NCI全扫描及EI MS MS比较质谱图 较大的化学噪生 且离子丰度不稳定 无化学噪生 离子丰度比稳定 负离子化学电离 a 先产生非常柔性 1 0eV 之电子CH4 e CH4 CH3 etc 2e thermal b 电子被电负性之分子捕获e MXMX non dissociative e MXM X dissociative NCI的缺点 对天然物的分析十分有限无卤族即无法测出須做衍生化方能做其他应用必須对样品做前处理衍生物会干扰谱图EI与CI间的切换繁琐需关机 放真空后才能更换离子源需要低温 高压 0 3torr 气体源以维持稳定之负离子 母离子选择的基本规则 母离子足够大保留的结构信息足够多能很好地产生二次电离MS MS质谱的稳定性 稳定的离子丰度比 原理 样品 C18小柱净化 硅胶小柱净化 氟罗里硅土小柱净化 衍生化 GC MS MS分析 GC MS MS分析 Column CP SIL8 30m 0 25mm内径 液膜厚度0 25 m 程序升温 60 0 5min 10 min升至300 保持10min 进样器温度280 传输线温度220 无分流进样 0 75min后放空 EI MS MS方式 二次母离子 225 监测离子 208 178 氯霉素衍生物全谱扫描的色谱图 氯霉素衍生物全扫描质谱图