车间菌种库的建立.doc

对来自车间的营养琼脂平板进行分离纯化以求得纯种菌株分离纯化含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图，a）图倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图，b）、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图4）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图4）、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。图4平板划线分离法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。我们采用的是平板划线分离法，具体步骤如下1倒平板 2划线3培养：将划线后的平板至于34.5度下培养，初步筛选，此后镜检是否为单一微生物，若有杂菌，继续分离纯化。纯化后的菌株就可以进行菌种鉴定了微生物的种类繁多,形态多样,应用广泛。在常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。从形态上区分,通常包括菌落形态(群体形态)和细胞形态(个体形态)两方面的观察。用肉眼直接观察和辨认菌落形态,是区分四大类微生物最常用的简便快速方法,它在菌种筛选、杂菌识别和菌种辨认等方面很有用处。四大类微生物的细胞形态是菌落形态的基础,而菌落形态又是细胞形态在群休聚集一起的反映。由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态,因而它们具有各自的菌落形态特征,这些特征可以从以下一些方面来描述,例如大小、形伏、结构、厚薄、色泽、透明度、粘稠度、致密度、表面粗糙及含水分状况、边缘特征以及菌落正反面的颜色是否一致等。在四大类微生物的菌落中,细菌和酵母菌形态较相似,放线菌和霉菌形态较相似。稠、圆形、隆起。而细胞较小的粘红酵母,菌落形似细菌。假丝酵母因其菌落边缘常产生丰富的藕节状假菌丝,故使细胞容易向外圈蔓延,造成菌落较大而扁平,表面不光滑和边缘不整齐的特有形态可分别用以下培养基去进行分离：灭菌的营养琼脂培养基（NA）、高氏一号培养基（G1）、虎红琼脂培养基（M）细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌一般形成较小的圆形菌落放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。放线菌菌落背面有时有同心圆形纹路大多数酵母菌形成的菌落与细菌的相似，但较细菌的菌落大而厚些，多呈现油脂状或腊脂状，表面光滑、湿润、粘稠、易被挑起。菌落多呈乳白色，少数为红色(如红酵母)。霉菌菌落通常以扩散方式向四周蔓延，菌丝较粗而长，形成的菌落较疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十倍。外观干燥，不透明。菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。通过肉眼观察并初步鉴别微生物类型，如果是细菌再做革兰氏阴性阳性鉴别。革兰氏染色法G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884 年由丹麦医师Gr 二创立的。革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye ）初染液；媒染剂（mordant ) ；脱色剂( decolorising agent ）和复染液（counter stain ）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet ）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ) 是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 的酒精（ethanol ）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G 一两大类群，常用的复染液是番红。操作步骤1 涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2 染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解