具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的体内骨结合.doc

www.CRTER.org李德超，等. 具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的体内骨结合具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的体内骨结合李德超，刘惠萍，李慕勤，刘 苗(佳木斯大学，黑龙江省高校生物医学材料重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154007)引用本文：李德超，刘惠萍，李慕勤，刘苗. 具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的体内骨结合J.中国组织工程研究，2016，20(43):6438-6444.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.008 ORCID: 0000-0003-0927-9530(李慕勤)文章快速阅读：具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层钛合金种植体的骨结合能力李德超，男，1970年生，黑龙江省佳木斯市人，汉族，教授，博士，主要从事口腔种植方面的研究。 通讯作者：李慕勤，教授，佳木斯大学，黑龙江省高校生物医学材料重点实验室，黑龙江省佳木斯市154007中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)43-06438-07稿件接受：2016-07-23结果表明：具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体具有较高的骨结合能力活性，可促进早期成骨置入后2，4，6周，采用锥形束CT、荧光显微镜、扭力实验检测种植体-骨界面早期成骨情况置入具有微弧氧化膜层的钛合金种植体、微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体与微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体建立双侧下颌骨种植窝文题释义：褪黑素：已被证实对骨质疏松症、牙科植入物的骨整合作用及牙本质的形成均有作用。它的作用为抗氧化、清除自由基、增加免疫和护骨，是刺激成骨和骨改建的重要调节者，抑制破骨细胞的分化，促进成骨细胞合成和分化；早期阶段(2-4周)褪黑素可能刺激更多的细胞分化，加速皮质骨合成、类骨质分化，导致新生皮质骨的长度、宽度均增加。微弧氧化：又称微等离子体氧化，是通过电解液与相应电参数的组合，在铝、镁、钛及其合金表面依靠弧光放电产生的瞬时高温高压作用，生长出以基体金属氧化物为主的陶瓷膜层。摘要背景：钛合金种植体与骨界面结合的强度不理想，延长了种植体与周围骨组织的愈合时间。目的：为进一步提高钛合金口腔种植体的早期愈合能力，对钛合金种植体进行表面改性，观察其骨结合能力。方法：分别制备具有微弧氧化膜层的钛合金种植体(设为A组)、微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体(设为B组)与微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体(设为C组)。将3种种植体分别置入新西兰大白兔下颌骨中，置入后2，4，6周，采用锥形束CT、荧光显微镜、扭力实验检测种植体-骨界面早期成骨情况。 结果与结论：锥形束CT检查结果：置入后6周，A组种植体与下颌骨结合不紧密；C组种植体与下颌骨结合紧密，骨结合最好；B组骨结合情况介于两者之间；荧光显微镜观察结果：3组种植体置入4周的荧光最强，6周时稍有减弱，C组不同时间点的荧光强度高于A、B组；扭力实验结果：随着置入时间的延长，3组种植体骨结合力逐渐增强，C组不同时间点的骨结合力高于A、B组(P 0.05)；结果表明：具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体具有较高的骨结合能力活性，可促进早期成骨。关键词：生物材料；口腔生物材料；钛种植体；种植体-骨界面；偶联剂；褪黑素；骨结合；国家自然科学基金 主题词：牙种植体；骨结合；组织工程基金资助：国家自然科学基金(31370979)；黑龙江省高校创新团队建设计划项目(2012TD010)；佳木斯大学协同创新中心(2011xtcx2016-02)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 In vivo osseointegration of micro-arc oxidation-silane-melatonin-covered titanium alloy implantLi De-chao, Liu Hui-ping, Li Mu-qin, Liu Miao (Key Biomedical Materials Laboratory of Colleges and Universities in Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China)AbstractBACKGROUND: Imperfect strength of titanium alloy implant-bone interface delays bone healing.OBJECTIVE: In order to further improve the early healing ability of titanium dental implants, to make the surface modification of titanium alloy implant and observe the osseointegration ability of the implant.METHODS: Titanium alloy implants were coated with micro-arc oxidation (group A), micro-arc oxidation-silane (group B), and micro-arc oxidation-silane-melatonin (group C) coatings, respectively. Three kinds of implants were placed into the mandible of New Zealand white rabbits, and 2, 4, 6 weeks after implantation, implant-bone interface osseointegration was observed using cone-beam CT, fluorescence microscopy, and torsion test.RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cone-beam CT examination: 6 weeks after implantation, the osseointegration of the implant with the mandible achieved the best results in the group C, followed by group B and group A. (2) Fluorescence microscope observation: the implants in the three groups exhibited the strongest fluorescence at 4 weeks and slightly weakened at 6 weeks, and the fluorescence intensity was higher in the group C than the other two groups. (3) Torsion test: with implantation time prolonged, the implant-bone osseointegration activity gradually increased in the three groups, while it was still highest in the group C (P 0.05). In summary, our results show that the titanium alloy implant coated with micro-arc oxidation-silane-melatonin composite coating has higher osseointegration activity and promotes bone formation.Subject headings: Dental Implants; Synostosis; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31370979; the Innovation Team Building Project in Heilongjiang Provincial Colleges, No. 2012TD010; Collaborative Innovation Center of Jiamusi University, No. 2011xtcx2016-02Cite this article: Li DC, Liu HP, Li MQ, Liu M. In vivo osseointegration of micro-arc oxidation-silane- melatonin-covered titanium alloy implant. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6438-6444.Li De-chao, M.D., Professor, Key Biomedical Materials Laboratory of Colleges and Universities in Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, ChinaCorresponding author: Li Mu-qin, Professor, Key Biomedical Materials Laboratory of Colleges and Universities in Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China6439ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction由于商业钛及其合金的低弹性模量、特殊生物相容性、优良腐蚀性而被广泛用作生物医学材料，尤其是将其作为牙科植入物具有很高的成功率1。但也因其为生物惰性材料，不易与活骨直接接触，使接触骨结合的周期及强度也比较漫长，限制了它的临床应用范围。因此，近些年学者们集中研究通过种植体表面改性处理来提高其生物活性，将钛合金转换为具有更好生物活性的材料，通过提高种植体与骨界面的成骨活性及结合强度来缩短种植体与周围骨组织的愈合时间2。钛经微弧氧化处理后可形成一层多孔结构的二氧化钛膜层，且与“骨小梁”的结构相似，利于骨整合3。但在处理过程中会有许多的微孔和微裂纹形成，而表面形成的二氧化钛膜层涂层生物活性相对较弱4。褪黑素为一种具有骨诱导活性的物质，可通过直/间接途径影响骨的代谢，主要能够与成骨/破骨细胞调整Ca2+的代谢平衡。研究发现，钛金属表面经硅烷修饰后有利于细胞的铺展、增殖与分化、合成细胞外基质，促进组织愈合，改善材料表面生物活性5。为了进一步提高钛合金口腔种植体的生物活性，实验的设计思想是将活性优异的褪黑素载入钛合金微弧氧化多孔表面，通过硅烷化作为偶联剂，一是联接微弧氧化二氧化钛膜层涂层和褪黑素，二是对添充裂纹。利用微弧氧化及后处理工艺技术制备微弧氧化-硅烷-褪黑素复合涂层，使种植体表面的复合陶瓷层具有更好的生物活性，并置入动物体内，对其在活体骨组织内的生物性能进行骨结合初步研究。将钛合金微弧氧化陶瓷层引入褪黑素，构建复合膜层，研究动物体内生物学行为少有报道。通过研究，期待能够为了获得良好的种植体表面处理技术而提供一条方便、快捷的新途径，加速种植体早期的愈合能力，为材料的临床应用提供理论依据。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 对比观察实验。1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年12月佳木斯大学生命科学学院完成。1.3 材料 实验动物：20周龄雄性新西兰白兔18只，体质量2.5-3.5 kg，由佳木斯大学基础医学院动物实验中心提供，动物合格证编号为SCXK(黑)2014005，分笼适应性饲养。实验过程中对动物的处置复合中华人民共和国科学技术部的关于善待实验动物的指导性意见。钛种植体表面改性实验的主要材料、试剂及仪器：褪黑素(浙江黄岩褪黑素有限公司)；钛合金种植体(沈阳智德真空科技有限公司)；体积分数4%甲醛溶液(沈阳市华东试剂厂)；速眠新(春农牧大学兽医研究所)；电动马达、低速手机(佳木斯大学医学实验室)；口腔外科器械包、陶瓷划片切割机(佳木斯大学材料学院)；扭力实验机TLB型(嵊州市帕克工具厂)。1.4 实验方法 种植体的制备：将纯钛棒制成带螺纹圆柱状种植体，规格为3.5 mm7.0 mm。所有种植体按以下操作进行：丙酮15 min、无水乙醇15 min和去离子水15 min清洗表面，干燥后备用。将已准备的72个钛种植体试样经HF、HNO3混合液酸蚀2 min，干燥后进行微弧氧化。电解液为Na3PO4、KOH、KF、植酸的混合溶液，阴极为不锈钢、阳极为试样，微弧氧化参数电压为400 V，频率为500 Hz，脉宽为100，微弧氧化时间5 min。随机选取24个微弧氧化钛合金试样作为A组，将剩下的48个试样放入配好的硅烷水解液中浸提，制备微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体，选择其中24个，设为B组；再将剩余的24个经硅烷浸提干燥后试样，放入50 nmol/L 褪黑素溶液中浸泡10 min，制备微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体，设为C组，室温下甩干备用。 动物模型的建立与分组干预6：取18只新西兰大白兔，肌注速眠新0.2 mL/kg，下颌骨下缘备皮，0.5%碘伏、体积分数75%乙醇消毒，2%利多卡因局麻。在下颌骨外侧咬肌前、下颌下缘上5 mm处，依次切开皮肤、筋膜、肌肉、骨膜，切口长度2.0-3.0 cm，钝性分离达骨面，低速牙钻生理盐水冷却下，在每只兔每侧分别制备2个种植窝(3.5 mm7.0 mm、间距3 mm)，生理盐水反复冲洗后，置入A、B、C 3组种植体，顶端与骨面平行，青霉素冲洗，充分止血，逐层严密缝合创口，皮肤消毒，转向对侧，同样方法进行另一侧。术后0.5%碘伏消毒创口，肌注庆大霉素3 d，1 mL/d，保持创口处的清洁，以免感染。 1.5 主要观测指标 置入后2，4，6周，随机取6只兔处死，进行以下指标检测。 一般观察：术后密切注意动物的进食、活动及体质量改变等情况；创口红肿、溢脓、瘘道、有无继发性骨折等现象。动物处死取材后将种植体周围软组织尽量去净，观察置入材料周围的组织是否有化脓、坏死现象及与周围组织的关系，以及骨愈合等情况。 锥形束CT观察：将置入6周的标本取材后24 h内拍摄锥形束CT，观察种植体与周围骨组织的结合情况，植体周围骨的硬度及密度情况，特别留意是否有坏死及吸收等现象。 荧光标记观察：于置入2，4，6周处死动物前13，14 d，于动物颈部皮下注射钙黄绿素6 mg/kg各1次，将骨块经金刚砂片取双侧下颌骨制成含种植体的 1.5 cm1.5 cm2 cm骨块，分别进行固定、脱水、透明、浸润、树脂包埋后7-12，用陶瓷划片切割机切成300 m左右，然后手工磨片至70 m左右，在488 nm激发波长的激光共聚焦显微镜下观察植体-骨界面新骨形成的荧光标记带分布情况。 生物力学测试：评价种植体与周围骨组织的结合强度，通常于取材后24 h内完成。记录置入2，4，6周时间点各组种植体扭出时的最大值作为骨结合的力值，算出扭力平均值并进行组间的比较。1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件对3组种植体置入后的骨结合强度进行比较统计分析。具体方法用重复测量的方差分析，不同处理组组间、相隔时间点之间采用LSD的两两比较。数据以s表示，检验水准a=0.05。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 18只兔均进入结果分析。2.2 术后一般情况 所有实验动物均于术后2 h 左右清醒，进食、行动良好，没有其他不适现象。定期清创，1 d/次，创口区域愈合良好，未见明显感染及种植体脱落，双侧颌下区无异常情况。取材后所有植体保存完好，均未松动及脱落，种植体骨结合良好区域顶部有骨质覆盖，周围无软组织化脓、感染及坏死现象。2.3 种植体锥形束CT检查结果 图1是兔下颌骨单侧种植区三维及不同断面形貌图，用于宏观观察种植体置入后与周围骨组织的结合情况，用锥形束CT在不破坏样本下进行的扫描，取得三维形貌，观察种植体的冠状面、横断面和矢状面。矢状面上能够清晰观察到种植体周围的骨结合情况。种植体置入的方向、位置适当，兔下颌骨均未出现低密度影像，无置入部位的排斥及感染现象，2个种植体之间的距离合适，无骨吸收及坏死现象。图2是置入6周后3组植体矢状面锥形束CT影像，A组靠近种植体周围两侧均有低密度阴影区，种植体两侧的密度低于正常区域最为明显，说明种植体两侧骨结合不紧密，新骨未在两侧完全生长；B组种植体周围密度明显比A组升高，但植体一侧仍存在低密度影，说明植体一侧有骨结合；C组种植体的周围未见到低密度影，与下颌骨结合紧密,且植体周围密度高于A、B组，相对比较，C组的骨结合最好。2.4 激光共聚焦镜下观察结果 骨组织中的Ca2+能与荧光标记物特异性结合，在特定波长激发光下的荧光显微镜中观察到的特殊颜色可以显示骨组织，实验中种植体-骨界面新生骨着色饱和、亮度高、呈绿色；而兔下颌骨(即宿主骨)着色较浅，为淡绿色，软组织在显微镜下没有显示颜色，见图3。置入2周时，A组种植体周围的荧光条带成点状、断续排列且强度较弱；B组弱的荧光形成细条线状排列在种植体-骨界面周围；C组植体-骨界面的荧光强度较A、B组强，但不连续排列，只有少部分成亮绿色。置入4周时，相比较而言，3组种植体周围的荧光标记明显比2周强，呈现亮绿色荧光。其中A组的荧光带较细、狭窄、断断续续；B组较A组来说荧光带明显增宽；而C组的荧光强度最强且较多，连续状，靠近种植体-骨界面处的强荧光带最宽。置入6周时，荧光带明显减少，强度减弱；但仍可以观察到C组的条带较A、B组宽；A组为片状排列，B组为细条带状。2.5 生物力学检测结果 图4为置入不同时间3组种植体的扭力值变化图。3组种植体的骨结合力存在着明显差异，随着置入时间的延长力值逐渐增加；相同置入时间点内，C组骨结合强度高于B组，B组又高于A组(P均 0.001)，说明C组的骨结合力优于A、B组；C组置入2，4，6周时的骨结合强度分别为(29.580.56)，(59.53 1.52)，(58.441.93) Ncm，说明C组种植体置入4周时的骨结合力达到峰值，表明骨结合时间少于A、B组 (P 0.05)。图5为3组种植体在各时间段内的骨结合力变化差异图，3组种植体均在2-4周时扭力值变化差距最为显著，4-6周时扭力值变化差距减少，且以C组2-4周时差距最为明显，说明骨代谢活跃期在2-4周，C组的骨代谢最为活跃。3 讨论 Discussion种植体材料多为钛及其合金，但其自身生物活性不足，在临床应用中也出现了许多的问题。对材料的表面改性成为了种植体研究中的主要方向。从种植体置入到其行使功能8-12周，如何能缩短种植体与骨组织结合的时间及增强骨整合，使其更加可靠稳固的行使功能，逐渐被学者们广泛关注。近些年研究中，褪黑素已被证实对骨质疏松症、牙科植入物的骨整合及牙本质的形成均有作用13-15。它的作用为抗氧化、清除自由基、增加免疫和护骨，是刺激成骨和骨改建的重要调节者，抑制破骨细胞分化，促进成骨细胞合成和分化；早期阶段(2-4周)褪黑素可能刺激更多的细胞分化，加速皮质骨合成、类骨质分化，导致新生皮质骨的长度、宽度均增加16-17。小鼠MC3T3-E1研究里显示，褪黑素抑制破骨细胞的合成与分化是通过增加核因子B配体的受体激活子、骨保护素的mRNA水平来完成的，延缓骨吸收过程，增加骨量18-19。低浓度下(10 nmol/L )，褪黑素能促进体外人成骨细胞型胶原纤维的合成。此外，它还能显著增加成骨细胞相关标记物的表达，如唾液酸糖蛋白、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、前成骨细胞中的骨钙素基因表达水平，刺激形成体外矿化基质，直接加速成骨细胞分化从而促进骨组织的生 成20-21。研究证实，钛金属表面经硅烷化处理后，能明显改善材料的物理及化学性能，不仅能诱导细胞的生长与黏附，有效促进组织与材料间的生物学结合，而且让种植体-骨界面间更加牢固结合，显著提高了材料细胞的相容性22。利用硅烷化将生物活性物质褪黑素附着于钛种植体表面，形成能够控制细胞形态、功能的表面，使材料的细胞相容性明显提高，促进骨结合作用。实验结果表明，3种种植体各时间段种植体均未松动、脱落，锥形束CT显示种植体与骨组织间的结合比较紧密，有一定的新生骨组织形成，材料同骨组织之间有良好的组织相容性，表面处理后的种植体没有刺激性及毒性。荧光标记可以动态了解成骨的进程，钙黄绿素为亚氨基二乙酰酸类化合物，不仅与新矿化骨中Ca2+结合，也与成熟骨质中Ca2+结合，在特定激发光的荧光显微镜下显示为绿色荧光，随新骨沉积的增加，光亮度增强23-25。激光共聚焦结果显示，3组种植体在置入4周时的荧光最强，6周时稍有减弱，说明骨代谢活跃期为2-4周，新骨形成量也最多；4-6周时荧光带逐渐缩窄，说明骨代谢趋于稳定，骨质逐渐成熟，其中以浸泡褪黑素骨成熟最好。6443ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHA组B组C组置入2周置入4周置入6周图5 不同种植体置入不同时间段内的扭力值变化差异 Figure 5 Difference in torsion values in each group at different time after implantation 图注：A 组置入具有微弧氧化膜层的钛合金种植体，B组置入具有微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体，C组置入具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体。3组种植体均在2-4周时扭力值变化差距最为显著，4-6周时扭力值变化差距减少，且以C组2-4周时差距最为明显，说明骨代谢活跃期在2-4周，C组的骨代谢最为活跃。扭力(Ncm)2周4周6周A组 B组 C组65605550454035302520151050图3 荧光标记置入不同时间各组种植体周围骨组织(50)Figure 3 Fluorescent tags around the implant bone implanted at different time (50)图注：A 组置入具有微弧氧化膜层的钛合金种植体，B组置入具有微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体C组置入具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体。白色箭头示种植体，红色箭头示种植体-骨界面区域。3组种植体置入4周的荧光最强，6周时稍有减弱，C组不同时间点的荧光强度高于A、B组。图4 各组种植体置入后不同时间段的扭力值变化 Figure 4 Variation of torsion in different groups at different time after implantation 图注：A 组置入具有微弧氧化膜层的钛合金种植体，B组置入具有微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体，C组置入具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体。相同置入时间点内，C组骨结合强度高于B组，B组又高于A组(P均 0.001)。扭力(Ncm)A组B组C组2周 4周 6周65605550454035302520151050C组B组A组图2 各种种植体置入6周时的矢状面锥形束CT影像图Figure 2 Cone-beam CT sagital plane of the implants at 6 weeks after implantation图注：图中A 组置入具有微弧氧化膜层的钛合金种植体，种植体与下颌骨结合不紧密；B组置入具有微弧氧化-硅烷复合膜层的钛合金种植体，B组骨结合情况介于A组、C组之间；C组置入具有微弧氧化-硅烷-褪黑素复合膜层的钛合金种植体，种植体与下颌骨结合紧密，骨结合最好。图1 兔下颌骨单侧种植区三维及不同断面形貌图Figure 1 Three-dimensional and different cross-sectional topography of unilateral mandibular implant in the rabbit mandible矢状面三维形貌冠状面横断面检测种植体周围的骨结合力，可将种植体从骨组织中旋出，间接反映不同时间点的骨结合强度，组别不同的种植体和愈合的周期对种植体表面的结合强度也有一定的影响26-27。扭力实验可以看出随着置入时间的延长，3组种植体的骨结合力越来越强，力值越来越大，两者呈正相关(P 0.05)。C组在4周时的力值为(59.531.52)Ncm，6周时为(58.441.93) Ncm，说明在4周时C组的骨结合强度达到最强，与周围骨组织的结合为最好的效果，相对于其他两组而言，骨愈合的时间缩短，这与激光共聚焦显微镜下观察的结果一致，扭力实验直观量化地表达骨结合强度，因而能够作为衡量骨结合强度的重要指标之一28-29。微弧氧化及后处理工艺制备复合涂层的种植体植入到动物体内可刺激骨形成，具有骨传导性30-39。其中，C 组的生物相容性较为优异。 综合分析以上研究结果，经微弧氧化及后处理工艺制备的微弧氧化-硅烷-褪黑素复合涂层具有非常良好的力学性能及生物相容性，可与骨组织形成直接结合，缩短骨组织愈合时间，此工艺操作简洁方便，是一种非常有临床应用价值的种植体材料表面处理方法。经微弧氧化及后处理工艺得到的微弧氧化-硅烷-褪黑素复合涂层相对于微弧氧化-硅烷涂层和单纯微弧氧化涂层而言，具有更好的生物相容性及骨传导性能，能更快的地促进种植体周围成骨细胞的增殖与分化，加速新生骨组织的形成。作者贡献：李德超、李慕勤进行实验设计，实验实施为刘苗、刘惠萍，实验评估为李德超、刘苗，资料收集为刘惠萍，刘惠萍成文，李德超、李慕勤审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Deng Z,Wang L,Zhang D,et al.Lanthanum-containing hydroxyapatite coating on ultrafine-grained titanium by micro-arc oxidation: A promising strategy to enhance overall performance of titanium.Med Sci Monit. 2014; 20(3):163-166.2 Oshida Y,Tuna EB,Aktren O,et al.Dental 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